ここで人間の鼻粘膜上皮細胞の三次元回転楕円体文化を生成する手法について述べる。回転楕円体は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) ドライブに刺激される-依存イオンと液分泌、「CFTR 機能のプロキシとして回転楕円体内腔サイズ変化を定量化します。
一方、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) 変調器薬の導入ケア嚢胞性線維症 (CF) に革命をもたらしました、現在使用している遺伝子型指向療法モデルはいくつかの制限を持っています。最初、稀なまたは流変異グループは、決定的な臨床試験から除外されます。また、追加の変調器薬市場に参入、個々 の主題の変調器の選択を最適化することは困難になります。両方のこれらの問題は「CFTR 機能変調の患者由来、個別の前臨床モデル システムを使って解決されます。ひと鼻粘膜上皮細胞 (HNEs) は、このようなモデルのための呼吸器組織の簡単にアクセス可能なソースです。ここで、「CFTR 機能と主な HNEs を用いた変調方式の三次元回転楕円体モデルの生成について述べる.HNEs は、低侵襲のファッション、条件付きのリプログラミング条件に拡大し、回転楕円体の文化にシードの被験者から分離されています。種まきの 2 週間以内に回転楕円体の文化生成 3′, 5′-環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を刺激することができます HNE スフェロイド-アゴニスト「CFTR 機能アクティブするを生成します。回転楕円体の腫れは CFTR の活性のプロキシとして、定量化されます。HNE 回転楕円体は、低侵襲、まだ呼吸疾患の罹患率と死亡率を反映した上皮に関連するアクセス可能なパーソナライズされたモデルを生成する鼻の細胞の起源を活用します。気液界面 HNE 文化に比べると、回転楕円体は、成熟する比較的簡単な汚染率を減らします。現在の形態でモデルは組織の買収の相対的な容易さは相殺されて、低スループットによって制限されます。確実に定量化し、個々 のレベルで「CFTR 活動を特徴付ける HNE 回転楕円体を使用できます。CFTR 変調に対する患者の反応の真の臨床予測かどうか HNE 回転楕円体は、生体内で薬剤応答にこの数量を結ぶ継続的な研究を決定します。
嚢胞性線維症 (CF) は、約 7万人の世界1に影響を与える致命的な常染色体性劣性遺伝性疾患です。この人生短縮遺伝病は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ蛋白質 (CFTR)2で突然変異によって引き起こされます。CFTR 胃腸、汗腺を含む複数の偏光上皮細胞の頂端膜を渡る塩化物、重炭酸塩の動きを許容するイオン チャネルとして機能や、アデノシン三リン酸結合カセット家族のメンバーであります。・呼吸器病3,4の木の他の中で。など、「CFTR 機能不全は呼吸器疾患1から生じるほとんどの死亡率と多臓器の上皮障害につながります。CFTR 駆動気道表面液体 (ASL) 規制と粘液のリリースにつながる厚く粘液、気道閉塞、慢性感染症、進行性気道リモデリングと肺機能1、5の損失は、CF の肺。
病気の原因として「CFTR 機能障害の識別、にもかかわらず CF 療法は、伝統的症状 (例えば、膵酵素補充療法、気道クリアランス療法)1軽減焦点を当てた。このアプローチは、最近「CFTR 変調」「CFTR 機能不全を直接対象すると呼ばれる新規の治療法の出現によって革命化されました。このアプローチは、疾患修飾に症状マネジメントから臨床の風景をシフトしている気が、いくつかの制限6,7,8,9,10を運ぶ。変調器の活動は各 CFTR の突然変異に伴うタンパク質の欠陥に特定、限られた遺伝的個体群11を選択します。この制限は、まれな突然変異グループでの臨床試験の実行によっても異種タンパク質の欠陥、性質によって駆動されます。さらに、よく研究遺伝子多型 (例えばF508del/F508del CFTR CFTR の最も一般的な突然変異)、被験者の間ではばらつきが大きく、疾病負担と変調器応答6,7,8 ,9,11。
両方のこれらの問題を克服するため、捜査官は前臨床試験12のパーソナライズされたモデルの使用を提案している.この概念は、パーソナライズされた方法で治療する生体内で件名応答予測複合テスト、個別前のヴィヴォモデル システムを生成する患者特有の組織を利用しています。されましたら、臨床医が患者の基になる CFTR 遺伝子型に関係なくドライブ精度療法はこのようなモデルを使用可能性があります。
人間の肺移植の時に植組織から得られた気管支の上皮 (HBE) 細胞は、CF13,14のためのようなモデルの可能性を設立しました。HBEs 気液界面 (アリ) で成長して電気生理学的検査から直接または間接的 ASL 恒常性13,15の措置を通じて機能の CFTR の定量化を可能にします。このモデルは CFTR の生物学を理解するための重要なている、CFTR 変調器16の開発の重要なドライバーだった。残念ながら、HBE モデルはこれらのまれな変異や軽度の病気 (肺移植または気管支擦過) 買収の侵襲的な性質とサンプルの不足のためのパーソナライズされたモデルとして理不尽ではありません。個別「CFTR 機能17,18,を勉強する腸内電流測定 (ICM) または腫れベースにおけるアッセイの腸組織、直腸または十二指腸生検標本から得られたを使用ことができます逆に、19. Organoid 試金、特に、CFTR 活動20,21,22の非常に機密性の高いモデルであります。両方のモデルは、組織ソース (腸組織、ほとんどの病は呼吸器) と半侵襲的買収法によって制限されます。また、いくつか調査官はモデル CFTR 復元23,24,25に人間の鼻粘膜上皮 (HNE) の細胞を研究しています。HNEs はブラシまたはあらゆる年齢層の被験者で掻爬によって安全に収穫できるし、アリで培養した場合 HBEs25,26,27,28の多くの特徴を要約するでしょう。HNE 単層培養は扁平上皮の変換と成熟度29に長い時間によって伝統的に制限されています。また、報告されて短絡 HNEs で電流の測定が治療効果の25を検出する小さいウィンドウを示唆している HBEs のそれらより小さい。
「CFTR 機能のパーソナライズされた、非侵襲的呼吸器の組織培養モデルの必要性を考える我々 は HNEs の非侵襲的・呼吸器病の自然と腫れベースにおけるアッセイの感度をマージしようとしました。ここでは、腫れを用いた測定30個別 CFTR の研究のための HNEs の 3 次元「回転楕円体」文化を生成する手法について述べる。HNE スフェロイド二極化確実に球の中心、または内腔に向かって上皮の頂点。このモデルは、下気道上皮の多数の特徴を繰り返す、アリの文化よりも早く成熟します。機能アッセイとして HNE 回転楕円体は確実に範囲の「CFTR 機能としてよく研究の突然変異のグループ (例えば、F508del CFTR) で変調を定量化します。この腫れベースの試金を直接測定されない流体流入回転楕円体に水が根尖部の塩排出を通り CFTR のイオン/塩の輸送特性における大文字します。この方法で機能的 CFTR の誘導回転楕円体膨らむ頑健、CFTR 機能不全とのそれら、うねりの少ない縮小中。これは事前のイメージ分析を通して定量化され、1 h 後刺激の回転楕円体、内腔領域を測定し、割合の決定を変更します。この測定は、患者特異的薬物活性のスクリーニング実験群間で比較できます。
このプロトコルでは、患者由来鼻細胞スフェロイド培養「CFTR 機能個別の特定モデルを生成することができるの生成について説明します。難しさを避けるために密接に出席する必要がありますプロセスでいくつか重要な手順があります。まずは患者さんの鼻から良いサンプル集録です。良いサンプルがあるはず > 50,000 セルは、粘液/破片の限定および 4 時間以内 (ただし、成功は、一晩氷で送?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、嚢胞性線維症財団治療によって支えられた、数 CLANCY14XX0 を付与し、嚢胞性線維症財団を通じて付与数 CLANCY15R0。患者の募集と規制監督で彼女の援助のクリスティーナ レイを感謝致します。また、著者は HNE ワーキング グループは、嚢胞性線維症財団、HNE 文化機能の世代の支援者に支えを感謝したい: プレストン Bratcher カルバン綿、マルティナ ・ Gentzsch、エリザベス Joseloff、マイケル ・ Myerburg、デイブ ・ ニコルズスコット ・ ランデル、スティーブ Rowe、G. マーティ ソロモン、キャサリン Tuggle。
1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |