Summary

Мыши и человека, полученных первичных желудка эпителиальных монослойном культивировании для изучения регенерации

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

Здесь мы описываем протокол для создания и культивирования человека и мыши, полученных 3-мерной organoids желудка (3D) и метод для передачи 3D organoids 2-мерной монослоя. Использование желудочного эпителиальных монослоя как Роман пробирного скретч раны для регенерации исследования также описал.

Abstract

В vitro исследования желудка рану ремонта обычно предполагает использование линий клеток рака желудка в скретч раны assay пролиферации и миграции. Одно из критических ограничений таких анализов, однако, является их однородной ассортимент клеточных типов. Ремонт — сложный процесс, который требует взаимодействия нескольких типов клеток. Таким образом для изучения культуры лишены клеточных подтипы, является опасение, что необходимо преодолеть, если мы хотим понять процесс восстановления. Желудка органоид модель может облегчить эту проблему, которой разнородной коллекции типов клеток тесно отражает эпителии желудка или другой родной тканей в естественных условиях. Продемонстрировали здесь-это роман, в пробирке скретч раны пробирного производным от человека или мыши 3-мерной organoids, которые затем могут быть переданы желудка эпителиальных монослоя, как либо нетронутыми organoids или одну ячейку перерыва в отрыве organoids. Цель Протокола заключается в создании производных органоид желудка эпителиальных монослои которые могут использоваться в системе Роман скретч раны пробирного для изучения желудка регенерации.

Introduction

Использование скретч раны анализов является популярным методом для изучения ремонта и регенерации1,2,3,4,5,6. Предлагаемая методология может использоваться специально изучать желудка регенерации и колонизации Helicobacter pylori . В прошлом линии клеток рака желудка были использованы как средство для изучения инфекции Helicobacter pylori (H. пилорусов)1,2 и до недавно желудка рак клеточных линий, таких как AGS клетки были благоприятствования1 ,2,3,4. Одним из ограничений культур клеток рака желудка является их неспособность пилки сотовой разнообразие желудка эпителия. Чтобы попытаться решить это ограничение, продемонстрировали здесь является создание и передачи первичных человека и мыши производных 3-мерной fundic желудка organoids (FGOs) для желудка эпителиальных монослоя для исцеления анализов раны сначала на основе модифицированного метода характеризуется Schlaermann и др. 7 мы продемонстрировали, что желудка эпителиальных монослои, производный от сдвиговых 3D желудочного FGOs или FGO-производные отдельные клетки сохраняют поляризованные клеточный состав, который тесно представляет что желудка эпителия в vivo. Учитывая, что линии клеток рака желудка не демонстрируют клеточный состав, который отображает эту технику, текущий протокол имеет преимущество над альтернативных скретч раны пробирного методы. Эта методология была оптимизирована, whereby монослои может быть установленным от всей organoids или одну ячейку подвеска от диссоциированных organoids и покрытием с помощью базальной мембраны матрицы или коллагена покрытием. Общая цель настоящего Протокола заключается в установить органоид производными желудка эпителиальных монослоя культур для исцеления assay Роман рану.

Protocol

Чтобы избежать заражения, выполните протокол в полном объеме в стерильных культуры ткани капюшоном. Fundic тканей человека была собрана из пациентов, перенесших рукав гастрэктомии согласно утвержденным Университета Цинциннати IRB протокол (номер протокола IRB: 2015-4869).Все мыши исследовани…

Representative Results

Organoids были получены от корпус/тело человека или глазного дна желудка тканей мыши (рис. 1A). Соответственно, после ЭДТА пищеварения человека или мыши, полученных ткани желудка или коллагеназы железы внедренные в матрицу базальной мембраны и культивировал…

Discussion

Текущий протокол подробности создания человека и мыши, полученных желудка эпителиальных монослои которые могут использоваться для анализов скретч раны. Протокол зависит от концепции резидентов стволовых клеток тканей изоляции от первичного человека (или мыши) и измененный Протокол ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана на низ (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 Грант (YZ).

Materials

Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) Life Technologies 12634-010
GlutaMAX (L-glutamine) Life Technologies 25030-081
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Amphotericin B/Gentamicin Thermo Scientific R01510
Kanamycin Thermo Fisher RO1510
HEPES Buffer Sigma Aldrich H0887
n-Acetylcystine Sigma Aldrich A9165
N2 Life Technologies 17502-048
B27 Life Technologies 12587-010
BMP Inhibitor (Noggin) Pepro Tech 250-38
Gastrin Tocris 3006
EGF Pepro Tech 315-09
FGF10 Pepro Tech 100-26
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Y-27632 ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TGF-β Inhibitor Tocris 2939
Ca2+/Mg2+ -free DPBS Fisher 21-031CV
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum FBS
OPTIMEM Invitrogen
0.22µM filter Fisher 099-720-004
37 °C Water Bath
Collagenase Type 1 Worthington  LS004214
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
Kimwipes (tissue paper) Fischer Scientific 06-666C
125 mL round bottom flask
1 in (25 mm) stir bar
Rubber Septa
Sterile Gauze
Stir Plate
Ring Stand
Ring Stand Clamps
Sterile petri dish
18 G needles of 1.5 in length Thermo Fisher 305196
20 G spinal needles of 3.5 in length Thermo Fisher 405182
12-well cell culture treated plate Midwest Scientific 92012
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) Fisher CB-40230C
Sterile Razor Blades
Wide-tip tweezers
Curved Hemostatic Forceps
200 µL wide pipette tips Thermo Fisher 02-707-134
5 mL cell culture test tubes Fisher 14-956-3C
Oxygen Tank with rubber hosing
1 g D-Sorbitol
Sucrose Fisher SS-500
Dissecting microscope
Dissecting Tray
Rocking Table
Rat Tail Collagen Type 1 Life Technologies A10483-01
Cell culture grade glacial acetic acid Fisher A38-212
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
2-well chamber slide Thermo Fisher 155380
12-well Transwell (polyester membrane inserts) Corning 3460
Cell scraper Corning 353086
Accutase (cell detachment solution) Stemcell Technologies 7920
263/8 G syringe Thermo Fisher 309625
Razor blade
L Cells L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).   N/A
HEK-293T Rspondin secreting cells A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ).   N/A
HK-ATPase Primary Antibody Invitrogen SC-374094
E-Cadherinn SantaCruz sc-59778
UEA1 Sigma Aldrich L9006
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) ThermoFisher Scientific R37114

References

  1. Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
  2. Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
  4. Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
  5. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  6. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
  9. Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
  10. Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
  11. Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
  12. Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
  13. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
  14. Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).

Play Video

Cite This Article
Teal, E., Steele, N. G., Chakrabarti, J., Holokai, L., Zavros, Y. Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57435, doi:10.3791/57435 (2018).

View Video