Summary

再生の研究のための主な胃上皮単層培養のマウスおよびひと由来

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

ここを確立する、2 次元の単分子膜に 3 D オルガノイドを転送する人間およびマウス由来 3 次元 (3 D) 胃 organoids、およびメソッドを培養するためのプロトコルについて述べる。再生研究の新規スクラッチ傷アッセイとして胃上皮単層の使用を述べる。

Abstract

胃の傷の修復のin vitro研究は通常細胞拡散および移行のスクラッチ傷アッセイの胃癌細胞株の使用を含みます。このような試金の 1 つの重要な制限は、携帯電話型の同種の品揃えです。修復は、いくつかの細胞のタイプの相互作用を要求する複雑なプロセスです。したがって、細胞のサブタイプに欠けている文化を研究する場合は修復プロセスを理解し、克服する必要があります懸念です。胃におけるモデルという携帯型の異種のコレクションは密接に胃の上皮やその他のネイティブの組織の生体を反映この問題を軽減するかもしれない。ここでは、小説で人間から派生したスクラッチ傷生体外の試金を示したマウスの 3 次元 organoids どちらかそのまま organoids やの単一細胞懸濁液として、胃上皮単層に移すことが分離したかorganoids。プロトコルの目的は、胃の再生を研究する新しいスクラッチ傷アッセイ システムで使える organoid 派生胃上皮膜を確立することです。

Introduction

スクラッチ傷の試金の使用は、修復と再生1,2,3,4,5,6を研究するための一般的な方法です。提案された方法論は、特に胃の再生とピロリ菌の植民地化を研究するために使えます。過去には、胃癌細胞株は、ヘリコバクター ・ ピロリ(ピロリ菌) 感染症1,2を研究する手段として使用されている、最近胃癌まで AGS 細胞などの細胞が支持された1 ,2,3,4。胃癌細胞培養の制限の 1 つは胃上皮細胞の多様性を要約する彼らの失敗です。この制限に対処しようとするには、ここでは確立とひと-マウス由来の主な 3 次元腺胃 organoids (FGOs) の転送に実証最初修正法に基づく創傷治癒の試金のための胃上皮単層Schlaermannによって記述されました。7を示すことから派生した胃の上皮膜せん断 3 D 胃 FGOs または FGO 単一細胞胃上皮密接に表す偏極細胞構成を保持体内。胃癌細胞株は、このテクニックが表示されますセル構成を示すか、ことを考える現在のプロトコルは代替のスクラッチ傷の測定法にはない利点です。この方法論は、単分子膜はできる全体 organoids や解離 organoids から単一細胞懸濁液から確立されたと基底膜マトリックスを使用してメッキまたはコラーゲン ・ コーティングという最適化されています。このプロトコルの全体的な目標は、organoid 派生小説創傷治癒の試金のための胃上皮単層培養を確立することです。

Protocol

汚染を避けるためには、滅菌のティッシュ文化フードの内で完全にプロトコルを実行します。承認されたシンシナティ大学 IRB プロトコルに従ってスリーブ胃切除術を受けている患者から収集されたヒトの腺組織 (IRB プロトコル番号: 2015-4869)。すべてのマウスの研究は、シンシナティ大学の制度的動物のケアおよび使用委員会 (IACUC) アメリカ協会の評価・認定の研究所動物ケア (AAALAC) 施設…

Representative Results

Organoids はコーパス/人間の体またはマウス胃組織 (図 1 a) の眼底のいずれかから派生しました。それぞれ、コラゲナーゼや胃組織の人間またはマウス由来の EDTA 消化後腺が基底膜マトリックスに埋め込まれ、6-7 日間 (図 1 a) 培養します。図 1 bは、ひと由来胃 organoids (huFGOs) 基底膜マトリックス コーテ?…

Discussion

現在のプロトコルは、スクラッチ傷のアッセイに使用することができます人間とマウス由来胃上皮膜の確立を詳しく述べる。プロトコルは居住者の幹細胞主の人間 (またはマウス) から分離組織の概念に依存、修正されたプロトコルが Schlaermann7で初めて公開されます。特に、合流を確立するここのプロトコルを最適化して胃の上皮単層的に表現する主要な細胞体?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH (NIDDK) 5 を支えられた R01 DK083402-07 (YZ) を付与します。

Materials

Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) Life Technologies 12634-010
GlutaMAX (L-glutamine) Life Technologies 25030-081
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Amphotericin B/Gentamicin Thermo Scientific R01510
Kanamycin Thermo Fisher RO1510
HEPES Buffer Sigma Aldrich H0887
n-Acetylcystine Sigma Aldrich A9165
N2 Life Technologies 17502-048
B27 Life Technologies 12587-010
BMP Inhibitor (Noggin) Pepro Tech 250-38
Gastrin Tocris 3006
EGF Pepro Tech 315-09
FGF10 Pepro Tech 100-26
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Y-27632 ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TGF-β Inhibitor Tocris 2939
Ca2+/Mg2+ -free DPBS Fisher 21-031CV
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum FBS
OPTIMEM Invitrogen
0.22µM filter Fisher 099-720-004
37 °C Water Bath
Collagenase Type 1 Worthington  LS004214
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
Kimwipes (tissue paper) Fischer Scientific 06-666C
125 mL round bottom flask
1 in (25 mm) stir bar
Rubber Septa
Sterile Gauze
Stir Plate
Ring Stand
Ring Stand Clamps
Sterile petri dish
18 G needles of 1.5 in length Thermo Fisher 305196
20 G spinal needles of 3.5 in length Thermo Fisher 405182
12-well cell culture treated plate Midwest Scientific 92012
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) Fisher CB-40230C
Sterile Razor Blades
Wide-tip tweezers
Curved Hemostatic Forceps
200 µL wide pipette tips Thermo Fisher 02-707-134
5 mL cell culture test tubes Fisher 14-956-3C
Oxygen Tank with rubber hosing
1 g D-Sorbitol
Sucrose Fisher SS-500
Dissecting microscope
Dissecting Tray
Rocking Table
Rat Tail Collagen Type 1 Life Technologies A10483-01
Cell culture grade glacial acetic acid Fisher A38-212
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
2-well chamber slide Thermo Fisher 155380
12-well Transwell (polyester membrane inserts) Corning 3460
Cell scraper Corning 353086
Accutase (cell detachment solution) Stemcell Technologies 7920
263/8 G syringe Thermo Fisher 309625
Razor blade
L Cells L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).   N/A
HEK-293T Rspondin secreting cells A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ).   N/A
HK-ATPase Primary Antibody Invitrogen SC-374094
E-Cadherinn SantaCruz sc-59778
UEA1 Sigma Aldrich L9006
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) ThermoFisher Scientific R37114

References

  1. Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
  2. Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
  4. Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
  5. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  6. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
  9. Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
  10. Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
  11. Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
  12. Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
  13. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
  14. Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).

Play Video

Cite This Article
Teal, E., Steele, N. G., Chakrabarti, J., Holokai, L., Zavros, Y. Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57435, doi:10.3791/57435 (2018).

View Video