Summary

העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

כאן נתאר פרוטוקול על יצירה וערבה culturing האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי (3D) קיבה organoids, ואת שיטת להעברת organoids תלת-ממד טפט 2-ממדי. השימוש טפט אפיתל הקיבה כמו assay הרומן פצע שריטה ללימודי התחדשות גם מתואר.

Abstract

מחקרים במבחנה של הפצע קיבה תיקון בדרך כלל כרוכה בשימוש של שורות תאים סרטן קיבה ב וזמינותו פצע שריטה של התפשטות תאי והעברה. מגבלה קריטית אחת של מבחני כזה, זאת, מבחר סוגי הסלולר הומוגני שלהם. תיקון הוא תהליך מורכב אשר דורש את האינטראקציה של מספר סוגי תאים. לכן, ללמוד תרבות ללא יחוברו הסלולר, היא דאגה שחייבים להכריעו אם ברצוננו להבין את תהליך התיקון. המודל תא צורב קיבה עשויה להקל על הבעיה לפיה האוסף הטרוגנית של סוגי תאים מקרוב משקף של האפיתל קיבה או אחרים רקמות מקורי בתוך vivo. הפגינו כאן הוא רומן, במבחנה פצע שריטה assay נגזר מן האדם או בעכבר organoids תלת-ממדי אשר אז ניתן להעביר טפט אפיתל הקיבה כמו גם organoids שלמים או השעיה תא בודד של חלופה מועדפת organoids. המטרה של הפרוטוקול היא להקים תא צורב-derived קיבה אפיתל monolayers יכול לשמש במערכת assay פצע שריטה הרומן ללמוד התחדשות קיבה.

Introduction

השימוש של מבחני פצע שריטה היא שיטה פופולרית לימוד תיקון והתחדשות1,2,3,4,5,6. המתודולוגיה המוצעת עשוי לשמש ללמוד במיוחד התחדשות קיבה ו קולוניזציה הליקובקטר פילורי . בעבר, שורות תאים סרטן קיבה שימשו כאמצעי ללמוד הליקובקטר פילורי (ח פילורי) זיהום1,2 , עד סרטן קיבה לאחרונה היו שורות תאים כגון תאים AGS המועדף1 ,2,3,4. מגבלה אחת של תרביות תאים סרטן הקיבה היא כשל שלהם כדי לסכם את הגיוון הסלולר של האפיתל קיבה. כדי לנסות לטפל מגבלה זו, הדגים שהנה הממסד ואת ההעברה של ראשי האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי fundic קיבה organoids (FGOs) אפיתל חד שכבתי קיבה עבור מבחני ריפוי הפצע המבוסס על שיטה שונה קודם שתואר על ידי Schlaermann et al. 7 נדגים כי monolayers אפיתל הקיבה נגזר לכסנתם FGOs קיבה תלת-ממד או תאים בודדים נגזר FGO שומרים על קומפוזיציה הסלולר מקוטב המייצג בצורה הקרובה של האפיתל קיבה ויוו. בהתחשב בכך שורות תאים סרטן קיבה לא מפגינים את ההרכב תא שטכניקה זו מציגה הפרוטוקול הנוכחי יש יתרון על פני שיטות אלטרנטיבית assay שריטה-פצע. מתודולוגיה זו מוטבה לפיה monolayers יכול להיות הוקמה כל organoids או השעיה תא בודד מן organoids הפומבית, מצופה שימוש במטריצה קרום המרתף או ציפוי קולגן. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור שתא צורב נגזר תרבויות קיבה אפיתל חד שכבתי assay הריפוי הפצע הרומן.

Protocol

כדי למנוע זיהום, לבצע פרוטוקול בשלמותו בתוך כיסוי סטרילי תרביות רקמה. רקמה אנושית fundic נאסף מתוך בחולים שעברו ניתוח שרוול קיבה לפי הפרוטוקול באוניברסיטת סינסינטי IRB שאושרו (מספר פרוטוקול IRB: 2015-4869).כל המחקרים העכבר אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת סינסינטי ועל שימוש הווע?…

Representative Results

Organoids נגזר קורפוס/גוף האדם או הפונדוס של רקמות הקיבה העכבר (איור 1 א’). לאחר collagenase או EDTA העיכול של האדם או עכבר-נגזר רקמת הקיבה בהתאמה, בלוטות מוטבע לתוך קרום המרתף מטריקס, תרבותי במשך 6-7 ימים (איור 1 א’). איור 1B מדגים את היווצרות…

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי מפרט הקמתה של האדם ואת העכבר-נגזר קיבה אפיתל monolayers יכול לשמש עבור מבחני שריטה-פצע. הפרוטוקול תלוי המושג תושב תאי בידוד האדם הראשי (או עכבר) ברקמות, פרוטוקול ששונה מתפרסם לראשונה על ידי Schlaermann et al7. בפרט, יש אופטימיזציה פרוטוקול כאן להקים confluent ואנו מקוטב טפ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 הענק (yz ימאהה).

Materials

Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) Life Technologies 12634-010
GlutaMAX (L-glutamine) Life Technologies 25030-081
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Amphotericin B/Gentamicin Thermo Scientific R01510
Kanamycin Thermo Fisher RO1510
HEPES Buffer Sigma Aldrich H0887
n-Acetylcystine Sigma Aldrich A9165
N2 Life Technologies 17502-048
B27 Life Technologies 12587-010
BMP Inhibitor (Noggin) Pepro Tech 250-38
Gastrin Tocris 3006
EGF Pepro Tech 315-09
FGF10 Pepro Tech 100-26
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Y-27632 ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TGF-β Inhibitor Tocris 2939
Ca2+/Mg2+ -free DPBS Fisher 21-031CV
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum FBS
OPTIMEM Invitrogen
0.22µM filter Fisher 099-720-004
37 °C Water Bath
Collagenase Type 1 Worthington  LS004214
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
Kimwipes (tissue paper) Fischer Scientific 06-666C
125 mL round bottom flask
1 in (25 mm) stir bar
Rubber Septa
Sterile Gauze
Stir Plate
Ring Stand
Ring Stand Clamps
Sterile petri dish
18 G needles of 1.5 in length Thermo Fisher 305196
20 G spinal needles of 3.5 in length Thermo Fisher 405182
12-well cell culture treated plate Midwest Scientific 92012
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) Fisher CB-40230C
Sterile Razor Blades
Wide-tip tweezers
Curved Hemostatic Forceps
200 µL wide pipette tips Thermo Fisher 02-707-134
5 mL cell culture test tubes Fisher 14-956-3C
Oxygen Tank with rubber hosing
1 g D-Sorbitol
Sucrose Fisher SS-500
Dissecting microscope
Dissecting Tray
Rocking Table
Rat Tail Collagen Type 1 Life Technologies A10483-01
Cell culture grade glacial acetic acid Fisher A38-212
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
2-well chamber slide Thermo Fisher 155380
12-well Transwell (polyester membrane inserts) Corning 3460
Cell scraper Corning 353086
Accutase (cell detachment solution) Stemcell Technologies 7920
263/8 G syringe Thermo Fisher 309625
Razor blade
L Cells L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).   N/A
HEK-293T Rspondin secreting cells A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ).   N/A
HK-ATPase Primary Antibody Invitrogen SC-374094
E-Cadherinn SantaCruz sc-59778
UEA1 Sigma Aldrich L9006
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) ThermoFisher Scientific R37114

References

  1. Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
  2. Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
  4. Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
  5. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  6. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
  9. Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
  10. Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
  11. Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
  12. Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
  13. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
  14. Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).

Play Video

Cite This Article
Teal, E., Steele, N. G., Chakrabarti, J., Holokai, L., Zavros, Y. Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57435, doi:10.3791/57435 (2018).

View Video