Aneuploidia leva à instabilidade do genoma, que eventualmente produz células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos. Este artigo fornece um método simples e conveniente para isolar células aneuploid com cariótipos complexos que deixam de dividir.
Segregação de mis cromossomo leva à aneuploidia, uma condição na qual células abrigam um número de cromossomas desequilibrado. Várias linhas de evidência indicam fortemente que aneuploidia provoca instabilidade do genoma, em última análise, gerando células com cariótipos complexos que prendam sua proliferação. Isolamento e caracterização de células abrigando cariótipos complexos são cruciais para estudar o impacto de um número de cromossomas desequilibrado na fisiologia celular. Até à data, não há métodos foram criados para isolar confiantemente tais células aneuploid. Este documento fornece um protocolo para o enriquecimento e a análise de células aneuploid com cariótipos complexos utilizando técnicas de cultura de tecidos de padrão, barato. Este protocolo pode ser usado para analisar várias características de células aneuploid com cariótipos complexos, incluindo seu fenótipo de secretora associada a senescência induzido, Propriedades pró-inflamatórias e capacidade de interagir com células do sistema imunológico. Porque as células cancerosas muitas vezes abrigam desequilíbrios no número de cromossomas, é crucial decifrar como aneuploidia impacta fisiologia celular em células normais, com o objetivo de desvendar os seus pro e anti tumorigenic efeitos.
Erros no processo de segregação do cromossomo levam a aneuploidia, uma condição caracterizada por um número de cromossomos que não é um múltiplo do haploide1,2,3,4. Cariótipos aneuploid stress de replicação de gatilho que gera ainda mais instabilidade genômica5,6,7,8,9,10, aumenta complexidade de cariótipo e, finalmente, leva a detenção do ciclo celular de uma subpopulação de células10. O objetivo do método apresentado aqui é gerar e separar tal uma subpopulação de células de ciclismo. Empregando-se técnicas de cultura de tecidos de baixo custo, este protocolo facilita o isolamento e caracterização de células aneuploid ciclo celular-preso com cariótipos complexos. Estas células são denominadas células ArCK (preso com cariótipo complexo) e os seus homólogos de ciclismo euploid como controles.
Este protocolo é o primeiro a ser criado para o efeito e permite o isolamento e um estudo mais aprofundado das linhas ArCK, incluindo, mas não limitado a, sua senescência induzida e o fenótipo secretor associada a senescência (SASP), seus pro-inflamatórios características e sua capacidade de envolver-se com células do sistema imunológico. O método aqui apresentado foi desenvolvido em células humanas sem transformação, imortalizadas, mas ainda não foi testado em linhas de câncer. Algumas células transformadas podem ser insensíveis à detenção do ciclo celular devido à supressão de um ou vários caminhos; Portanto, ainda mais validação deve ser executada em outras linhas de célula.
Este novo método para gerar e enriquecer para células presas com cariótipos complexos (ArCK) permite o estudo de células que possuem vários cromossomo ganhos ou perdas e deixam de dividir. A configuração do método foi projetada para facilitar o isolamento das células ArCK de forma rápida e confiável.
O passo mais crítico neste ensaio é controlar rigorosamente o cronograma de tratamento medicamentoso e, mais importante ainda, a remoção de células de ciclismo aneuploid. Para obter melhores resultados, o tempo do tratamento nocodazole e agitar-off é de particular importância para garantir que as células de ciclismo são removidas da placa enquanto eles ainda são arredondadas e mitótica, impedindo a possibilidade de morte celular mitótica ou derrapagem em G1, potencialmente, criando uma população tetraploide. Não se recomenda que o timing de agitar-se afasta-se mais de duas horas de incubação recomendada 12-h nocodazole.
Futuros estudos sobre ArCK células têm o potencial de facilitar uma compreensão mais profunda de como complexo cariótipos afetam a fisiologia celular. Em particular, um estudo recente demonstrou que as células do sistema imunológico são capazes de interagir com e gatilho imune apuramento de ArCK células10. O método descrito aqui fornece um excelente ponto de partida para a caracterização adicional das células ArCK, incluindo o esclarecimento dos mecanismos moleculares subjacentes a autorização imune em células sem transformação e o estudo da transformação oncogênica como pode contornar este mecanismo de vigilância, uma questão crucial no campo14,15.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte com o apoio do Instituto de Koch Grant P30-CA 14051 (núcleo) do Instituto Nacional de câncer, pelos institutos nacionais de Grant saúde (22-CA206157 e GM118066) e Curt mármore Cancer Research Fund de Angelika Amon. Angelika Amon também é um investigador do Howard Hughes Medical Institute e o Glenn Foundation para investigação biomédica. S. S. foi apoiado pelo americano italiano Cancer Foundation (AICF), por uma bolsa de pesquisa do câncer de acções Marie Curie e a associação italiana para pesquisa de câncer (AIRC) e por uma bolsa de pesquisa de câncer quinquenal do KI. E.M. foi apoiado por uma bolsa do Howard Hughes Medical Institute.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |