Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.
Chromosom MIS Trennung führt zu Aneuploidie, eine Bedingung, in denen Zellen eine unausgewogene Chromosomenzahl beherbergen. Einige Linien des Beweises deuten stark, dass Aneuploidie löst Genom Instabilität, letztlich Erzeugung von Zellen mit komplexen Karyotyp, die ihre Verbreitung zu verhaften. Isolierung und Charakterisierung von Zellen beherbergen komplexe Karyotypen sind entscheidend für die Auswirkungen einer unausgewogenen Chromosomenzahl auf Zellphysiologie untersuchen. Bisher wurden keine Methoden zuverlässig solche aneuploiden Zellen isolieren gegründet. Dieses Dokument enthält ein Protokoll zur Bereicherung und Analyse von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen standard, preiswerte Gewebekultur Techniken. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um mehrere Funktionen von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen einschließlich ihrer induzierte Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp, Pro-inflammatorische Eigenschaften und Fähigkeit zur Interaktion mit Immunzellen zu analysieren. Da Krebszellen oft Ungleichgewichte im Chromosom Nummer Hafen, ist es wichtig, zu entschlüsseln, wie Aneuploidie Zellphysiologie in normalen Zellen, mit dem Ziel der Aufdeckung seiner Pro und anti tumorigenic Effekte auswirkt.
Fehler in den Prozess der Trennung der Chromosomen führen zu Aneuploidie, ein Zustand, gekennzeichnet durch eine Chromosomenzahl, die kein Vielfaches der haploiden Ergänzung1,2,3,4. Aneuploidie Karyotypen Trigger Replikation Stress, die weiter genomische Instabilität5,erzeugt6,7,8,9,10, erhöht Karyotyp Komplexität, und letztlich zu Zellzyklus Festnahme von einer Subpopulation von Zellen10führt. Die hier vorgestellte Methode soll zu generieren und so eine Subpopulation aus dem Radsport Zellen zu trennen. Durch den Einsatz von preiswerten Gewebekultur Techniken, erleichtert dieses Protokoll die Isolierung und Charakterisierung des Zellzyklus verhaftet aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp. Diese Zellen werden als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotyp) Zellen und ihre euploide Radsport Gegenstücke als Steuerelemente bezeichnet.
Dieses Protokoll ist die erste, für diesen Zweck eingerichtet werden und ermöglicht für die Isolierung und weiter zu studieren, ArCK Linien einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ihre induzierte Seneszenz und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP), ihre Pro-inflammatorischen Funktionen und ihre Fähigkeit, mit Immunzellen zu engagieren. Die hier vorgestellte Methode entwickelt wurde, in den untransformierten, verewigt menschlichen Zellen aber in Krebs Linien noch nicht getestet. Einige transformierten Zellen möglicherweise unempfindlich gegen Zellzyklus Festnahme aufgrund der Unterdrückung der einen oder mehrere Pfade; Daher sollten weitere Validierung in anderen Zelllinien durchgeführt werden.
Diese neuartige Methode zu erzeugen und zu bereichern für festgenommene Zellen mit komplexen Karyotypen (ArCK) ermöglicht die Untersuchung von Zellen, die mehrere Chromosom Gewinne oder Verluste und aufhören zu teilen. Die Methode Setup wurde entwickelt, um die Isolation der ArCK Zellen auf eine schnelle und zuverlässige Weise zu erleichtern.
Der wichtigste Schritt in diesem Assay ist rigoros die Timeline der medikamentösen Behandlung und vor allem die Beseitigung von Radsport aneuploiden Zellen steuern. Um optimale Ergebnisse zu erzielen ist das Timing von Nocodazole Behandlung und Shake-off von besonderer Bedeutung, um sicherzustellen, dass Radfahren Zellen von der Platte entfernt werden, während sie noch abgerundet und mitotischen, die Möglichkeit der mitotischen Zelltod oder Schlupf in G1 zu verhindern, potenziell Erstellen einer tetraploiden Bevölkerung. Es wird nicht empfohlen, dass das Timing der Shake-aus mehr als zwei Stunden von der empfohlenen 12-h-Nocodazole-Inkubation abweicht.
Zukünftige Studien an Zellen das Potenzial haben, zu ein tieferes Verständnis der wie komplex Karyotypen erleichtern ArCK beeinflussen Zellphysiologie. Insbesondere zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass Zellen des Immunsystems in der Lage sind zu interagieren und Trigger immun Clearance von ArCK10 Zellen. Die hier beschriebene Methode bietet einen hervorragenden Ausgangspunkt für die weitere Charakterisierung der ArCK Zellen, einschließlich der Klärung von den molekularen Mechanismen immun Lichtung im untransformierten Zellen und die Studie wie Onkogenen Transformation kann dieser Überwachungsmechanismus, eine entscheidende Frage in das Feld14,15umgehen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Koch-Institut-Unterstützung (Kern) Grant P30-CA 14051 vom National Cancer Institute, von den nationalen Instituten der Gesundheit Grant (CA206157-22 und GM118066) und Curt Marmor Cancer Research Fund, Angelika Amon unterstützt. Angelika Amon ist auch ein Investigator am Howard Hughes Medical Institute und Glenn Foundation for Biomedical Research. S. S. wurde von der amerikanischen italienischen Krebs-Stiftung (AICF), durch ein Stipendium in der Krebsforschung von Marie-Curie-Maßnahmen und die italienische Vereinigung für Cancer Research (AIRC), und eine KI Quinquennial Cancer Research Fellowship unterstützt. E.M wurde durch ein Stipendium aus dem Howard Hughes Medical Institute unterstützt.
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |