Summary

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Published: April 06, 2019
doi:

Summary

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Abstract

Die Analyse der bioaktiven Komponenten in Lebensmittel und Naturprodukte ist ein beliebtes Gebiet der Studie in vielen Bereichen, einschließlich der traditionellen chinesischen Medizin und Lebensmittel Sicherheit/Toxikologie geworden. Viele der klassischen Analysetechniken erfordern teure Ausrüstung und/oder Know-how. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (Elisa) sind vor allem eine neue Methode für die Analyse von Lebensmitteln und natürlichen Produkten geworden. Diese Methode basiert auf Antikörper-vermittelten Erkennung von Zielkomponenten. Wie viele bioaktiven Komponenten bei Naturprodukten sind jedoch klein (< 1.000 Da) und keine Immunantwort auslösen, Erstellen von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen sie ist oft schwierig. In diesem Protokoll bieten wir eine ausführliche Erläuterung der Schritte erforderlich, um mAbs gegen Zielmoleküle als auch benötigt, um die damit verbundenen indirekten wettbewerbsfähig (ic) ELISA für die schnelle Analyse der Verbindung mehrerer Proben erstellen generieren. Das Verfahren beschreibt die Synthese des künstlichen Antigens (d. h. das Hapten-Carrier-Konjugat), Immunisierung, Zellfusion, monoklonalen Hybridom-Vorbereitung, Charakterisierung der MAB und die ELISA-basierten Anwendung der MAB. Das Hapten-Carrier-Konjugat wurde durch das Natrium synthetisiert periodate Methode und von MALDI-TOF-MS ausgewertet. Nach der Immunisierung, Splenocyten wurden isoliert von der immunisierten Maus mit der höchsten Antikörpertiter und verschmolzen mit der Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Hut) – sensible Maus Myelom Zelllinie Sp2/0 – Ag14 mit einem Polyethylenglykol (PEG)-basierte Methode. Die Hybridome sezernierenden mAbs reagiert auf das Ziel-Antigen wurden durch IcELISA für Spezifität und Kreuzreaktivität gezeigt. Darüber hinaus wurde die begrenzende Verdünnungsmethode angewandt, um monoklonale Hybridome vorzubereiten. Die endgültige mAbs waren weitere zeichnet sich durch IcELISA und dann in einem ELISA-basierten Anwendung zur schnellen und bequemen Detektion von Beispiel-Hapten (Naringin (NAR)) in natürlichen Produkten genutzt.

Introduction

Monoklonale Antikörper (MAK), auch bekannt als Mono-spezifische Antikörper werden aus einem einzigen zahlreiche Klon hergestellt und bestehen aus monovalenten Antikörper, dass alle an der gleichen Epitop1binden. In den letzten Jahren haben viele pflanzliche natürliche Arzneimittel bei der Behandlung von verschiedenen Krankheiten2verwendet worden. In der Tat sind viele kleine Molekülverbindungen ursprünglich abgeleitet aus Naturprodukten nun als Erstlinien Drogen wie Artemisinin für Malaria und Paciltaxel (Taxol) für Krebs2,3angewendet. Die Studie von Naturprodukten machte rasche Fortschritte, vor allem auf die enorme Entwicklung und Optimierung der herkömmlichen Analyse-Techniken, einschließlich Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie (MS). Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die diese Methoden, wie z. B. ihre komplexen Vorbehandlung Protokolle und die damit verbundenen Kosten in Bezug auf Zeit, Arbeit/Expertisen und erforderlichen Instrumente4zugeordnet.

Vor kurzem wurden Enzym-linked Immunosorbentprobe mAb basierende Assays (Elisa) angewendet, um Lebensmittel und natürliche Produkte qualitativ und quantitativ zu analysieren. In der Tat, diese Methode beantragt worden Analyse von biologischen Proben und klinische Tests und hat gezeigt, dass genau, empfindlich und höchst effizient zu sein, während auch die Vermeidung der mühsame Vorbehandlung Schritte verknüpft mit anderen Analysen5, 6.

Wenn mAb-basierte ELISAs verwenden, um komplexe natürliche Produkte zu studieren, ist Vorbereitung von monoklonalen Antikörpern eines der Kern-Schritte. Leider der mAbs speziell für kleinen bioaktiven Komponenten in diesen Arten von Substanzen6,7,8,9,10,11,12 vorhanden ,13,14,15 sind oft begrenzt, im Vergleich zu den Protein-Antigene. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir ein Protokoll, um speziell generieren mAbs gegen kleine Verbindungen entwickelt. Die hier vorgestellten Protokoll umfasst künstliche Antigen-Synthese, Maus Immunisierung Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung.

Vor allem unsere Forschungsgruppe die Bildung von mAbs gegen kleine bioaktiven Verbindungen, die aus der traditionellen chinesischen Medizin studiert und entwickeln ihre Anwendungen seit Jahren. In unseren laufenden Studien haben wir mAbs gegen Baicalin16, Puerarin17Glycyrrhizic Säure18, Paeoniflorin19, Ginsenoside Re20, Ginsenoside Rh121und viele andere kleine Moleküle entwickelt. Unsere ELISA-Protokolle basierend auf diese mAbs wurden in einer Reihe von Studien zur Pharmakokinetik von diesen kleinen Molekülen sowie ihre Interaktionen mit anderen bioaktiven Substanzen zu bewerten. Darüber hinaus entwickelten verwenden diese mAbs, auch Immunoaffinitäts Chromatographie Methoden zur Trennung von strukturelle Analoga, einschließlich Epimers wir. Vor kurzem haben wir eine lateral Flow Immunoassay mit unserer Anti-Puerarin mAb, die anschließend für schnelle, vor-Ort-Nachweis von dieser Verbindung verwendet wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere mAb basierende Assays unverzichtbar und praktische Werkzeuge sind für das Studium der Biologie und der Qualität der natürlichen Produkt abgeleitete Verbindungen, insbesondere in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet.

Protocol

Alle tierischen Verfahren durchgeführt, die in dieser Studie wurden von der ethischen Prüfungsausschuss an der Beijing University of Chinese Medicine (Genehmigung Nr. 2016BZYYL00109) genehmigt. Hinweis: Die weiblichen BALB/c Mäuse (8 Wochen alt) wurden mit Hapten-Carrier-Protein Konjugate immunisiert. Wenn Sie allein, ein kleines Molekül (< 1.000 Da) kann keine Immunantwort hervorrufen. Jedoch Konjugation das kleine Molekül in ein Träger Makromolekül führt in Antigen-Synthese. In diese…

Representative Results

Generierung von monoklonalen Hybridomen Das Molekulargewicht des Konjugats Hapten-Carrier wurde durch MALDI-TOF-MS-Analyse bestätigt. Da das Molekulargewicht des BSA und NAR bekannt sind, konnte die Anzahl von kleinen Molekülen mit BSA konjugierten berechnet werden. Abbildung 1 zeigt repräsentative spektrale Ergebnisse für NAR-BSA22, di…

Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die erfolgreiche Produktion von mAbs gegen natürliche Produkt abgeleitet kleine Moleküle. Die wesentlichen Schritte des Verfahrens umrissen worden, und wir haben bewiesen, dass die Nützlichkeit dieses Protokoll mit NAR als ein Beispiel kleines Molekül. Die Beispiel-Spektren, Reaktivität Analysen und IcELISA Ergebnisse zeigen Vertreter experimenteller und Steuerdaten, die mit diesem Protokoll abgerufen wird. Beispielbilder von der Hybridome bieten eine visuelle Darstell…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81573573, 81473338 und 81503344) und dem klassischen Rezept grundlegende Forschungsteam an der Beijing Universität der chinesischen Medizin unterstützt.

Materials

800 mesh (40 μm nylon) filter  FALCON 352340
24 well culture plate NUNC 119567
25 cm2 Flask Labserv 310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) Sigma Aldrich 860336 1G
75 cm2 Flask Corning 430720
96 well culture plate NUNC 117246
bovine serum albumin AMRESCO 332
cell strainer FALCON 352340
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
cryotubes, 1 mL  Sigma Aldrich V7384-1CS
cultivator DRP-9082  Samsung
dialysis membrane (10kDa) Heng Hui 45-10000D
dimethylsulfoxide Sinopharm Chemical DH105-10
electronic balance  BS124-S  Sartorius
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
ethanol, 96% Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
fetal calf serum Invitrogen 10270106
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete Sigma Aldrich SLBL0210V
Gelatin AMRESCO 9764-500g
Gradient cooler container Nalgene 5100-0001
HAT media supplement Sigma Aldrich H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
HT media supplement Sigma Aldrich H0137-10VL
Inverted Microscope IX73 Olympus 
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
MALDI-TOF-MS  Axima-CFR  plus   Axima 
Microplate Reader BioTex ELX-800 
mouse Vital River  BALB/c
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG Sigma Aldrich RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution Hyclone SV30010
Pipette 10 mL COSTAR 4488
Pipette 25 mL FALCON 357525
RPMI 1640 Corning 10-040-CVR
skim milk applygen P1622
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021

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Cite This Article
Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).

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