Summary

Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten

Published: April 06, 2019
doi:

Summary

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.

Abstract

De analyse van de bioactieve componenten aanwezig zijn in de voedingsmiddelen en natuurlijke producten uitgegroeid tot een populaire gebied van studie op vele terreinen, met inbegrip van traditionele Chinese geneeskunde en voedsel veiligheid/toxicologie. Veel van de klassieke analysetechnieken vereisen dure apparatuur en/of expertise. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) geworden met name, een nieuwe methode voor de analyse van de voedingsmiddelen en natuurlijke producten. Deze methode is gebaseerd op antilichaam-gemedieerde detectie van de doel-componenten. Echter, zoals veel van de bioactieve componenten in natuurlijke producten zijn klein (< 1.000 Da) en doen niet het opwekken van een immuunrespons, het creëren van monoclonal antilichamen (mAbs) tegen hen is vaak moeilijk. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde uitleg over de stappen die nodig zijn voor het genereren van mAbs tegen doel moleculen, alsmede degenen die nodig zijn voor het maken van de bijbehorende indirecte concurrerende (ic) ELISA voor de snelle analyse van de stof in meerdere monsters. De procedure wordt beschreven voor de synthese van de kunstmatige antigeen (dat wil zeggen, de geconjugeerde hapten-carrier) immunisatie, celfusie, monoklonaal hybridoma voorbereiding, karakterisatie van de mAb, en de ELISA gebaseerde toepassing van de mAb. De geconjugeerde hapten-carrier werd gesynthetiseerd door de natrium Perjodaat methode en geëvalueerd door de MALDI-TOF-MS. Na immunisatie, splenocytes werden geïsoleerd van de geïmmuniseerde muis met de hoogste antilichaam titer en gesmolten met de hypoxanthine-aminopterin-thymidine (hoed) – gevoelige muis myeloma cellijn Sp2/0 – Ag14 met behulp van een polyethyleenglycol (PEG)-op basis van de methode. De hybridomas afscheidende mAbs reactieve aan de target-antigeen waren gescreend door de icELISA voor de specificiteit en Kruisallergie. Bovendien, de beperkende verdunning-methode werd toegepast om te bereiden monoclonal hybridomas. De definitieve mAbs waren verder gekenmerkt door icELISA en vervolgens gebruikt in een ELISA gebaseerde toepassing voor de snelle en gemakkelijke opsporing van de voorbeeld hapten (naringin (NAR)) in natuurlijke producten.

Introduction

Monoclonal antilichamen (mAbs), ook bekend als mono-specifieke antistoffen, geproduceerd door een enkele lymfocyt kloon en zijn samengesteld uit monovalent antilichamen die alle aan hetzelfde epitoop1 koppelt. In de afgelopen jaren hebben vele plantgerelateerde natuurlijke geneesmiddelen gebruikt bij de behandeling van verschillende ziekten2. Inderdaad, veel kleine moleculaire verbindingen oorspronkelijk afgeleid van natuurlijke producten zijn nu toegepast als eerstelijns drugs, zoals artemisinine tegen malaria en paciltaxel (taxol) voor kanker2,3. De studie van natuurlijke producten heeft snelle vorderingen gemaakt, grotendeels te wijten aan de enorme ontwikkeling en optimalisatie van conventionele analysetechnieken, met inbegrip van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en massaspectrometrie (MS). Er zijn echter nog enkele beperkingen die zijn gekoppeld aan deze methoden, zoals hun complexe voorbehandelingsplatformen protocollen en kosten met betrekking tot tijd, arbeid/expertise en vereiste instrumenten4.

Onlangs, mAb gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) zijn toegepast om kwalitatief en kwantitatief te analyseren voedingsmiddelen en natuurlijke producten. In feite, deze methode is toegepast bij zowel biologische monsters analyses en klinische tests en gebleken te zijn nauwkeurig, gevoelig en hoogefficiënte terwijl ook het vermijden van de vervelende voorbehandelingsplatformen stappen die zijn gekoppeld aan andere analyses5, 6.

Bij het gebruik van mAb gebaseerde ELISAs om te studeren van complexe natuurlijke producten, is voorbereiding van het monoclonal antilichamen een van de stappen van de kern. Helaas, de mAbs specifiek voor de kleine bioactieve componenten aanwezig zijn in dit soort stoffen6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 zijn vaak beperkt in vergelijking met de eiwit antigenen. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een protocol voor het genereren van specifiek mAbs tegen kleine verbindingen. Het hier gepresenteerde protocol bevat kunstmatige antigeen synthese, muis immunisatie celfusie, indirecte competitieve ELISA en monoclonal hybridoma voorbereiding.

Met name is onze onderzoeksgroep het bestuderen van de vorming van mAbs tegen kleine bioactieve stoffen uit de traditionele Chinese medicijnen en ontwikkelen van hun toepassingen voor jaren. In onze aan de gang zijnde onderzoeken, hebben we mAbs tegen baicalin16, puerarin17, glycyrrizine zuur18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121en vele andere kleine moleculen. Onze ELISA-protocollen op basis van deze mAbs zijn gebruikt in een aantal studies om te evalueren van de farmacokinetiek van deze kleine moleculen, alsmede hun interacties met andere bioactieve stoffen. Bovendien, met behulp van deze mAbs, we hebben ook immunoaffinity chromatografie methodes ontwikkeld voor de scheiding van structuuranalogons daarvan, met inbegrip van epimers. Onlangs, wij bereid een laterale-flow-immunoassay met behulp van onze anti-puerarin mAb die vervolgens werd gebruikt voor snelle, on-site detectie van dit samengestelde. Onze resultaten wijzen erop dat onze mAb-gebaseerd testen onmisbaar en handige hulpmiddelen zijn voor de studie van de biologie en de kwaliteit van de natuurlijke product-afkomstige stoffen, met name die worden gebruikt in traditionele Chinese medicijnen.

Protocol

Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de beoordeling op de Universiteit van Peking van Chinese geneeskunde (goedkeuring nummer 2016BZYYL00109). Opmerking: Vrouwelijke BALB/c muizen (8 weken oud) werden geïmmuniseerd met hapten-carrier eiwit geconjugeerde. Wanneer gebruikt alleen een klein molecuul (< 1.000 Da) een immuunrespons kan niet uitlokken. Echter, conjugating de kleine molecuul aan een vervoerder macromolecule worden antige…

Representative Results

Generatie van monoclonal hybridomas Het molecuulgewicht van de geconjugeerde hapten-carrier werd bevestigd door MALDI-TOF-MS-analyse. Zoals het molecuulgewicht van zowel BSA en de NAR worden genoemd, kon het aantal kleine moleculen geconjugeerd met BSA worden berekend. Figuur 1 toont representatieve spectrale resultaten voor NAR-BSA22, waar…

Discussion

Hier presenteren we een protocol voor de succesvolle productie van mAbs tegen natuurlijke product afkomstige kleine moleculen. De essentiële stappen in de procedure hebben uitgestippeld, en we hebben laten zien het nut van dit protocol NAR gebruiken als een voorbeeld klein molecuul. De voorbeeld-spectra, reactiviteit analyses en resultaten van de icELISA alle Toon vertegenwoordiger experimentele gegevens en controles die wordt verkregen met behulp van dit protocol. Voorbeeld van de beelden van de hybridomas bieden een v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (subsidie nummers 81573573, 81473338 en 81503344) en het klassieke recept Basic onderzoeksteam aan de Universiteit van Peking van Chinese geneeskunde.

Materials

800 mesh (40 μm nylon) filter  FALCON 352340
24 well culture plate NUNC 119567
25 cm2 Flask Labserv 310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) Sigma Aldrich 860336 1G
75 cm2 Flask Corning 430720
96 well culture plate NUNC 117246
bovine serum albumin AMRESCO 332
cell strainer FALCON 352340
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
cryotubes, 1 mL  Sigma Aldrich V7384-1CS
cultivator DRP-9082  Samsung
dialysis membrane (10kDa) Heng Hui 45-10000D
dimethylsulfoxide Sinopharm Chemical DH105-10
electronic balance  BS124-S  Sartorius
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
ethanol, 96% Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
fetal calf serum Invitrogen 10270106
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete Sigma Aldrich SLBL0210V
Gelatin AMRESCO 9764-500g
Gradient cooler container Nalgene 5100-0001
HAT media supplement Sigma Aldrich H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
HT media supplement Sigma Aldrich H0137-10VL
Inverted Microscope IX73 Olympus 
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
MALDI-TOF-MS  Axima-CFR  plus   Axima 
Microplate Reader BioTex ELX-800 
mouse Vital River  BALB/c
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG Sigma Aldrich RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution Hyclone SV30010
Pipette 10 mL COSTAR 4488
Pipette 25 mL FALCON 357525
RPMI 1640 Corning 10-040-CVR
skim milk applygen P1622
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021

References

  1. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
  2. De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
  3. Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
  4. Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
  5. Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
  6. Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
  7. Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
  8. Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
  9. Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
  10. Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
  11. Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
  12. Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
  13. Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
  14. Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
  15. Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
  16. Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
  17. Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
  18. Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
  19. Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
  20. Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
  21. Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
  22. Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
  23. Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).

View Video