Summary

جيل من الأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية

Published: April 06, 2019
doi:

Summary

توفر هذه المقالة بروتوكول مفصلة لإعداد وتقييم للأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية لاستخدامها في مختلف تحديدكم. ويشمل هذا الإجراء التحصين، خلية الانصهار، أليسا المنافسة غير المباشرة لاستنساخ إيجابية الفحص، وإعداد هيبريدوما [مونوكلونل]. كما يتم توفير مواصفات جسم توصيف استخدام استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد وتحليل إليزا.

Abstract

تحليل المكونات النشطة بيولوجيا في الأطعمة والمنتجات الطبيعية أصبحت منطقة شعبية للدراسة في العديد من المجالات، بما في ذلك التقليدية الصينية الدواء والغذاء السلامة/علم السموم. تتطلب العديد من تقنيات التحليل الكلاسيكي معدات غالية الثمن و/أو الخبرة. جدير بالذكر أن فحوصات المرتبط بالانزيم المرتبط (الساس) أصبحت أسلوب ناشئة لتحليل الأطعمة والمنتجات الطبيعية. يستند هذا الأسلوب إلى الكشف عن الأجسام المضادة بوساطة من مكونات الهدف. ومع ذلك، كالعديد من المكونات النشطة بيولوجيا في المنتجات الطبيعية هي صغيرة (< دا 1,000) والحث على عدم استجابة مناعية، وغالباً ما يصعب إيجاد الأجسام المضادة (مابس) ضدهم. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم شرحاً مفصلاً للخطوات المطلوبة لإنشاء مابس ضد الجزيئات المستهدفة، فضلا عن تلك المطلوبة لإنشاء المرتبطة بها غير المباشرة التنافسية (ic) أليسا للتحليل السريع للمجمع في عينات متعددة. يصف الإجراء توليف مستضد اصطناعية (أي، المتقارن هابتين الناقل)، التحصين، خلية الانصهار، إعداد هيبريدوما [مونوكلونل]، وصف الإنسان والمحيط الحيوي، وتطبيق المستندة إلى أليسا الإنسان والمحيط الحيوي. المتقارن هابتين الناقل تم تصنيعه بالصوديوم فوق يودات الأسلوب وتقييمه بواسطة استخدام TOF-مللي ثانية. بعد التحصين، بمعزل عن الماوس المحصنين مع عيار الأجسام المضادة أعلى سبلينوسيتيس وتنصهر مع Ag14 (القبعة)–ماوس حساسة الورم النخاعي الخلية خط Sp2/0-هيبوكسانثيني-أمينوبتيرين-التريتيوم استخدام البولي إيثيلين غليكول (شماعة)-على أساس الأسلوب. تم فحص هيبريدوماس إفراز مابس رد الفعل على مستضد الهدف من إيسيليسا لخصوصية وه. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق الأسلوب إضعاف الحد لإعداد هيبريدوماس [مونوكلونل]. كذلك اتسمت إيسيليسا مابس النهائي وثم استخدامها في أحد تطبيقات المستندة إلى إليزا للكشف السريع ومريحة هابتين مثال (نارينجين (NAR)) في المنتجات الطبيعية.

Introduction

مونوكلونل (مابس)، يعرف أيضا باسم الأجسام المضادة أحادية محددة، يتم إنتاجها من استنساخ بليمفوسيتي واحدة وتتألف من الأجسام المضادة الفموي الأحادي التكافؤ أن كل ربط حانمه نفس1. في السنوات الأخيرة، استخدمت العديد من المنتجات الطبيعية المشتقة من النباتات الطبية في علاج الأمراض المختلفة2. وفي الواقع، تطبق الآن العديد من المركبات الجزيئية الصغيرة مستمد أصلاً من المنتجات الطبيعية كأدوية الخط الأول، مثل مادة الأرتيميسينين لعلاج الملاريا وباسيلتاكسيل (تاكسول) للسرطان2،3. دراسة المنتجات الطبيعية حققت تقدما سريعاً، إلى حد كبير بسبب تنمية هائلة والاستغلال الأمثل لتقنيات التحليل التقليدي، بما في ذلك كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) والطيف الكتلي (مللي ثانية). ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود المرتبطة بهذه الأساليب، مثل بروتوكولات المعالجة المعقدة والتكاليف المرتبطة بها فيما يتعلق بالوقت والعمل/الخبرة والأدوات المطلوبة4.

في الآونة الأخيرة، طبقت الاختبارات المستندة إلى ماب الممتز المرتبط بالانزيم (الساس) على كمياً ونوعيا في تحليل المواد الغذائية والمنتجات الطبيعية. في الواقع، هذا الأسلوب قد طبقت لتحليل العينات البيولوجية والتجارب السريرية وقد تبين أن تكون دقيقة وحساسة وذات كفاءة عالية في حين أيضا تجنب الخطوات مملة المعالجة المسبقة المرتبطة ب التحاليل الأخرى5، 6.

عند استخدام الساس ماب المستندة إلى دراسة المنتجات الطبيعية المعقدة، إعداد الأجسام المضادة واحدة من الخطوات الأساسية. ولسوء الحظ، مابس الخاصة بالمكونات النشطة بيولوجيا الصغيرة الموجودة في هذه الأنواع من المواد6،،من78،،من910،11،12 13، ،،من1415 غالباً ما تكون محدودة مقارنة بمولدات المضادات البروتين. للالتفاف حول هذه المسألة، وقد وضعنا بروتوكولا لإنشاء مابس ضد المركبات الصغيرة على وجه التحديد. يشمل البروتوكول المعروضة هنا التوليف مستضد اصطناعية الماوس، خلية الانصهار، ELISA التنافسية غير المباشرة والتحصين والإعداد هيبريدوما [مونوكلونل].

جدير بالذكر أن دراسة تشكيل مابس ضد المركبات النشطة بيولوجيا الصغيرة من الأدوية الصينية التقليدية لدينا مجموعة بحوث وتطوير التطبيقات الخاصة بهم لسنوات. وقد وضعنا في دراساتنا الجارية، مابس ضد بايكالين16، بويرارين17، وحامض glycyrrhizic18، بايونيفلورين19، جنسنوسد Re20، جنسنوسد Rh121والعديد من الجزيئات الصغيرة الأخرى. لدينا بروتوكولات أليسا استناداً إلى هذه مابس قد استخدمت في عدد من الدراسات لتقييم الدوائية هذه الجزيئات الصغيرة، فضلا عن تفاعلها مع غيرها من المركبات النشطة بيولوجيا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذه مابس، قد وضعنا أيضا أساليب اللوني إيمونوافينيتي لفصل نظائر الهيكلية، بما في ذلك ابيميرس. في الآونة الأخيرة، أعددنا المناعة تدفق أفقي استخدام لدينا ماب بويرارين المضادة التي استخدمت فيما بعد للكشف السريع، في الموقع لهذا المركب. نتائجنا تشير إلى أن لدينا فحوصات المستندة إلى ماب أدوات لا غنى عنها ومريحة لدراسة علم الأحياء ونوعية المركبات المشتقة من المنتجات الطبيعية، وخاصة تلك المستخدمة في الأدوية الصينية التقليدية.

Protocol

كافة الإجراءات الحيوان القيام في هذه الدراسة بموافقة “لجنة استعراض الأخلاقية” بجامعة بكين “الطب الصيني” (الموافقة على رقم 2016BZYYL00109). ملاحظة: تم تحصين الفئران الإناث بالب/c (8 أسابيع) مع يصرف البروتين الناقل هابتين. عندما تستخدم وحدها، جزيء صغير (< دا 1,000) لا يمكن الحصول على استجاب…

Representative Results

جيل هيبريدوماس [مونوكلونل] وأكد الوزن الجزيئي المتقارن الناقل هابتين تحليل استخدام TOF-مللي ثانية. كما هي معروفة الوزن الجزيئي لجيش صرب البوسنة والنار، يمكن حساب عدد الجزيئات الصغيرة مترافق مع جيش صرب البوسنة. ويبين <strong class="…

Discussion

نقدم هنا، بروتوكولا للنجاح في إنتاج مابس ضد الجزيئات الصغيرة الطبيعية المستمدة من المنتج. وقد أوجزت الخطوات الأساسية في الإجراء، وإننا قد أثبتت فائدة هذا البروتوكول استخدام نار كجزيء صغير مثال. المثال الأطياف وتحليلات مفاعليه، ونتائج إيسيليسا جميع إظهار الممثل التجريبية وبيانات التحكم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أيد هذا العمل الكلاسيكي الوصفة الأساسية فريق البحث بجامعة بكين “الطب الصيني” ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (منحة الأرقام 81573573 و 81473338 و 81503344).

Materials

800 mesh (40 μm nylon) filter  FALCON 352340
24 well culture plate NUNC 119567
25 cm2 Flask Labserv 310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) Sigma Aldrich 860336 1G
75 cm2 Flask Corning 430720
96 well culture plate NUNC 117246
bovine serum albumin AMRESCO 332
cell strainer FALCON 352340
centrifuge tube 15 mL Corning 430645
centrifuge tube 50 mL Corning 430828
cryotubes, 1 mL  Sigma Aldrich V7384-1CS
cultivator DRP-9082  Samsung
dialysis membrane (10kDa) Heng Hui 45-10000D
dimethylsulfoxide Sinopharm Chemical DH105-10
electronic balance  BS124-S  Sartorius
ELISA plates, 96 well NUNC 655101
ethanol, 96% Sinopharm Chemical
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
fetal calf serum Invitrogen 10270106
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich SLBM2183V
Freund´s adjuvant, incomplete Sigma Aldrich SLBL0210V
Gelatin AMRESCO 9764-500g
Gradient cooler container Nalgene 5100-0001
HAT media supplement Sigma Aldrich H0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody applygen C1308
HT media supplement Sigma Aldrich H0137-10VL
Inverted Microscope IX73 Olympus 
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
MALDI-TOF-MS  Axima-CFR  plus   Axima 
Microplate Reader BioTex ELX-800 
mouse Vital River  BALB/c
ovalbumin Beijing BIODEE 5008-25g
PEG Sigma Aldrich RNBC6325
Penicillin&Streptomycin solution Hyclone SV30010
Pipette 10 mL COSTAR 4488
Pipette 25 mL FALCON 357525
RPMI 1640 Corning 10-040-CVR
skim milk applygen P1622
sodium periodate Sinopharm Chemical BW-G0008
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021

References

  1. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
  2. De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
  3. Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
  4. Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
  5. Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
  6. Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
  7. Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
  8. Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
  9. Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
  10. Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
  11. Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
  12. Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
  13. Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
  14. Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
  15. Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
  16. Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
  17. Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
  18. Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
  19. Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
  20. Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
  21. Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
  22. Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
  23. Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Cao, P., Lu, F., Yan, X., Jiang, B., Cheng, J., Qu, H. Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products. J. Vis. Exp. (146), e57116, doi:10.3791/57116 (2019).

View Video