Summary

Модели мыши инфекции Helicobacter и патологий желудка

Published: October 18, 2018
doi:

Summary

Мышей представляют собой бесценный в vivo модель для изучения инфекции и заболеваний, вызванных желудочно-кишечные микроорганизмы. Здесь мы описываем методы, используемые для изучения бактериальной колонизации и гистопатологические изменения в моделях мыши Helicobacter pylori-связанных заболеваний.

Abstract

Helicobacter pylori это желудка возбудителя, который присутствует в половину мирового населения и является существенной причиной заболеваемости и смертности в организме человека. Несколько моделей мыши желудочной инфекции Helicobacter были разработаны для изучения молекулярных и клеточных механизмов, whereby H. пилори бактерий колонизировать желудок человека хостов и вызывают болезни. Здесь, мы описываем протоколы: 1) подготовить бактериальных суспензий для инфекции в vivo мышей через внутрижелудочного кормления; 2) определяет уровень бактериальной колонизации в мыши желудка тканях, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и жизнеспособной подсчета; и 3) оценки патологических изменений, по гистологии. Установить HelicobactЭр инфекции в мышей, конкретного возбудителя бесплатно (SPF) животных сначала прививанным с суспензий (содержащие ≥105 колонии формирование подразделения, CFUs) мыши колонизировать штаммов либо Helicobacter pylori или другие желудка Helicobacter spp. от животных, таких как Helicobacter felis. В соответствующие моменты времени после инфекции желудков подакцизным и расчлененный sagittally на два равных ткани фрагменты, каждое в составе области гайморовых и тела. Затем один из этих фрагментов используется для жизнеспособных подсчета или экстракции ДНК, в то время как другой подвергается гистологической обработки. Бактериальной колонизации и гистопатологические изменения в желудке может оцениваться регулярно в разделах ткани желудка, окрашенных с Warthin-звездное, Гимзы или гематоксилин и эозином (H & E) пятна, в случае необходимости. Дополнительные иммунологические анализы могут также осуществляться иммуногистохимия или иммунофлюоресценции на разделах желудка ткани мыши. Протоколы, описанные ниже предназначены специально для проведения оценки в мышах патологии желудка, напоминающие те в связанных с человека Helicobacter pylori заболеваний, включая воспаление, атрофия железы и формирования лимфоидных фолликулов. Подготовка посевным материалом и внутрижелудочного затравки протоколы могут быть адаптированы для изучения патогенеза других кишечных патогенов человека, которые колонизировали мышей, например Salmonella Typhimurium или Citrobacter rodentium.

Introduction

Helicobacter pylori это спираль образная, грамотрицательных, человеческого желудка патогена присутствуют в всех групп населения во всем мире, с заболеваемости в развивающихся странах, по оценкам, составляют порядка 80%1. Хотя большинство Helicobacter pylori-инфицированных протекает бессимптомно, некоторые развивать более тяжелых заболеваний, начиная от пептических язв желудка рак2. H. pylori-связанных рака характеризуются широко злокачественные изменения эпителиальных клеток (GECs) или формирования экстра узловой лимфоидной ткани в желудке, приводит к аденокарцинома желудка или слизистой оболочки, связанных лимфоидных ткани (MALT) лимфомы, соответственно. H. пилори высоко адаптирована к выжить в суровых экологическую нишу желудка из-за наличия различных факторов вирулентности и механизмов содействия его соблюдению, роста и метаболизма в этой нише. В частности вирулентным штаммов H. пилори обладают 40 КБ cag остров патогенности (cagPAI), который кодирует приблизительно 30 генов, необходимых для производства типа 4 секреторной системы (T4SS)3,4 . ЦАГ ПАЙ инфицированных штаммами Helicobacter pylori связаны с индукции более высокий уровень хронического воспаления в узле, который был вовлечен как основных прекурсоров аденокарцинома желудка5.

В естественных условиях Животные модели, особенно мышей, были весьма информативным, позволяя исследователей для изучения относительного вклада принимающих, бактериальных и экологических факторов на H. pylori инфекции и болезни результат6. Ранее исследования показали, что длительное пилорусов заражение мышей C57BL/6 генетический фон результатов в развитии хронического гастрита и железы атрофия, оба клейма Helicobacter pylori инфекции7. Кроме того было показано инфекции с смежных бактериальных видов кошачьих/собак, H. felis, вызывать образование солода в мышах с аналогичными патологии и прогрессирования заболевания как видно человека MALT лимфома8,9. Наиболее часто используемые пилорусов изолировать в мыши колонизации исследования является «Сидней штамм 1» (SS1) напряжение10, который cagПАЙ+ но нефункциональные T4SS (T4SS)11. Других широко используемых штаммов включают пилорусов B128 7.13 (cagПАЙ+/T4SS+)12 и X47 2AL (cagПАЙ/T4SS)13. H. felis инфекций, штамм CS1 («Cat спираль 1», ЦАГПАЙ/T4SS) — обычно используется14.

Здесь мы предоставляем протокол, описывающий подготовку Helicobacter инокуляты в vivo инфекции, процедура внутрижелудочного затравки мышей, а также методы для обработки тканей для изучения гистопатологические изменения в желудке. В частности эта статья будет сосредоточена на гистологических методов, используемых для визуализации бактериальной колонизации и оценить гистопатологические изменения, включая формирование солода, в слизистой оболочке желудка зараженных мышей. Некоторые из методов, описанных здесь могут быть адаптированы к изучению других кишки патогены, например S. Typhimurium или C. rodentium.

Protocol

1. рост и подготовка бактериальный инокуляты Оттепель запасы глицерина15 Helicobacter pylori или H. felisот-80 ° C и субкультуры на лошади пластины крови агар (HBA) состоит из: кровь агар основания №2 (см. Таблицу материалы); изменение «Скирроу антибиотик селективного…

Representative Results

Этот протокол описывает метод пероральная затравка для достижения внутрижелудочного инфекция с Helicobacter pylori или H. felis в мышиных мыши модели (рис. 1). После эвтаназии желудки удалены, взвешиваются и разделен на 2 равные половины, включающий антрального, тело и не же…

Discussion

Этот протокол описывает использование модели мыши в естественных условиях для инфекции Helicobacter . Важнейшие шаги процедуры являются: 1) подготовка Helicobacter инокуляты, содержащие жизнеспособные и подвижные бактерий; 2) доставки соответствующего числа бактерий к мыши через вн?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить г-жа A. де Паоли и г-жа Джорджи Рей-McCann для оказания технической помощи. Авторы признают, что использование средств и технической помощи Монаш гистология платформы, кафедра анатомии и биологии развития, Университет Монаш. Лаборатория поддерживает финансирование от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) RLF (APP1079930, APP1107930). RLF поддерживается старший стипендия исследований NHMRC (APP1079904). KD и MC поддерживаются в Монаш выпускник стипендии. KD также поддерживается центром врожденного иммунитета и инфекционные заболевания, Гудзоновский институт медицинских исследований, в то время как MC имеет международной аспирантов стипендии от факультета медицины, медсестер и медицинских наук, Университет Монаш. Исследования в Институте медицинских исследований Хадсон поддерживается викторианской правительство оперативной инфраструктуры поддержки программы.

Materials

Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2 Thermo Fischer Scientific CM0271B Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood Australian Ethical Biologicals PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth BD Bioscience 237500 Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs Thermo Fischer Scientific CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured ChemSupply AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol) Merck 100995
Xylene (sulphur free) ChemSupply XT003-20L
Mayer's Haematoxylin Amber Scientific  MH-1L Filter before use
Eosin, Aqueous Stain Amber Scientific EOCA-1L Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified Sigma Aldrich WG80-2.5L Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene Grale Scientific 11031/5
DPX mounting medium VWR 1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fischer Scientific Q32850
Oligonucleotides Sigma Aldrich The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega  M8291 Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs Bioline BIO-39028 Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose Bioline BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate Univar (Ajax Fine Chemicals) A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate Chem-Supply MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin Sigma Aldrich V2002-1G Dissolve in deionized water
Polymyxin B Sigma Aldrich P4932-5MU Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC) Sigma Aldrich T7883 Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin Amresco (Astral Scientific) E437-100MG Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis Sigma Aldrich B0125 Dissolve in deionized water
Naladixic acid Sigma Aldrich N8878 Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox) Medical Developments International Not applicable
Paraffin Wax Paraplast Plus, Leica Biosystems 39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars Thermo Fischer Scientific HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes Interpath Services 200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C
23g precision glide needle BD Bioscience 301805
Parafilm M Bemis, VWR PM996
Portex fine bore polythene tubing Smiths Medical 800/100/200
Plastic feeding catheters Instech  Laboratories FTP20-30
1 ml tuberculin luer slip disposable syringes BD Bioscience 302100
Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes Sigma Aldrich Z317314 Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap) Miltenyi Biotec 30-093-236
 Qubit Fluorometer Thermo Fischer Scientific Q33216
Sterile plastic loop LabServ LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System Leica Biosystems Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 Sakura, Alphen aan den Rijn 4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System Sakura, Alphen aan den Rijn 4170
Microtome, Leica RM2235 Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific 4951PLUS4

References

  1. Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
  2. Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
  3. Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
  4. Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
  5. Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
  6. O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
  7. Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
  8. Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
  9. Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
  10. Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
  11. Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
  12. Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
  13. Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
  14. Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
  15. Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
  16. Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
  17. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  18. Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
  19. Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
  20. Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
  21. Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
  22. Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
  23. Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
  24. Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
  25. Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
  26. Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
  27. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
  28. Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
  29. Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
  30. Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
  31. Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).

Play Video

Cite This Article
D’Costa, K., Chonwerawong, M., Tran, L. S., Ferrero, R. L. Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies. J. Vis. Exp. (140), e56985, doi:10.3791/56985 (2018).

View Video