Summary

نماذج الماوس الملوية العدوى وأمراض المعدة

Published: October 18, 2018
doi:

Summary

الفئران تمثل نموذجا لا تقدر بثمن في فيفو لدراسة العدوى والأمراض التي تسببها الكائنات الدقيقة المعدية المعوية. هنا، يمكننا وصف الطرق المستخدمة لدراسة الاستعمار الجرثومي وتغييرات نسيجية في نماذج الماوس الملوية البوابية-المتعلقة بالمرض.

Abstract

الملوية البوابية هو ممرض المعدة في نصف سكان العالم وهو سببا هاما للمراضة والوفيات لدى البشر. تم تطوير عدة نماذج الماوس المعدة الملوية العدوى دراسة الآليات الجزيئية والخلوية حيث H. pylori البكتيريا استعمار معدّة المضيفين الإنسان وتسبب المرض. هنا، يمكننا وصف البروتوكولات إلى: 1) تعد المعلقات البكتيرية للعدوى في فيفو من الفئران عن طريق إجراء تزقيمية مدتها؛ 2) تحديد مستويات الاستعمار الجرثومي في أنسجة المعدة الماوس، بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والعد قابلة للتطبيق؛ و 3) تقييم التغيرات المرضية، بعلم الأنسجة. لإنشاء هيليكوباكتer العدوى في الفئران، أولاً هي تلقيح الحيوانات (منتدى جنوب المحيط الهادئ) خالية من مسببات الأمراض خاصة مع تعليق (التي تحتوي على إيه وان زيرو5 الوحدات المكونة للمستعمرة، كفوس) من سلالات استعمار الماوس أما الملوية البوابية أو أخرى spp. الملوية المعدة من الحيوانات، مثل حطي الملوية. في العدوى بعد النقاط الزمنية المناسبة، اقتطعت بطون وتشريح ساجيتالي إلى أجزاء متساوية الأنسجة اثنين، كل منها يتألف من مناطق الجسم والتجويف. واحدة من هذه الشظايا ثم يستخدم للعد قابلة للتطبيق أو استخراج الحمض النووي، بينما الآخر يخضع لتجهيز غذائها. يمكن تقييم الاستعمار الجرثومي وتغييرات نسيجية في المعدة بشكل روتيني في أقسام الأنسجة المعدة ملطخة ببقع (H & E) النجوم Warthin، جيمسى أو هايماتوكسيلين وويوزين، حسب الاقتضاء. التحاليل المناعية إضافية قد تضطلع أيضا إيمونوهيستوتشيميستري أو الفلورة على أبواب أنسجة المعدة الماوس. البروتوكولات المبينة أدناه مصممة خصيصا لتمكين تقييم أمراض المعدة تشبه تلك التي تتعلق بالإنسان H. pylori في الفئران الأمراض، بما في ذلك التهاب وضمور الغدة وتشكيل جريب اللمفاوية. إعداد العدوى والبروتوكولات تزقيمية إجراء يمكن تكييفها لدراسة أمراض أخرى تصيب الإنسان المعوية أن استعمار الفئران، مثل Typhimurium السالمونيلا أو رودينتيوم المضاداتأيضا.

Introduction

الملوية البوابية ممرض المعدة على شكل دوامة، سلبية الغرام، والبشرية موجودة في جميع السكان عبر العالم، مع معدلات الإصابة في البلدان النامية وتقدر بحدود 80%1. على الرغم من أن معظم H. pylori-الأفراد المصابين بأعراض، ووضع بعض أشد الأمراض، بدءاً من تقرح الهضمية بسرطان المعدة2. H. pylori-تتميز السرطانات المرتبطة بها على نطاق واسع بتغييرات خبيثة في الخلايا الظهارية (جيكس) أو بتشكيل العقدي خارج الأنسجة اللمفاوية في المعدة، ونتج عنه غدية المعدة أو المرتبطة بالغشاء المخاطي الليمفاوي سرطان الغدد الليمفاوية الأنسجة (الشعير)، على التوالي. H. pylori هو تكييف عالية البقاء على قيد الحياة في مكانة الإيكولوجية القاسية في المعدة بسبب وجود عدة عوامل الفوعة واليات تيسير الانضمام، والنمو والايض في مكانة هذا. على وجه الخصوص، تمتلك خبثاً سلالات H. pylori كيلو بايت 40 كاج الجزيرة الإمراضية (cagPAI) الذي يشفر حوالي 30 الجينات المطلوبة للإنتاج من نوع 4 إفراز نظام (T4SS)3،4 . المساعدة النقدية PAI-إيجابية سلالات H. pylori المرتبطة بتنظيم دورات تعريفية لمستويات أعلى من التهاب مزمن في البلد المضيف، والذي كان متورطا باعتبارها مؤشرا أساسيا للمعدة غدية5.

وكانت في فيفو نماذج حيوانية، لا سيما من الفئران، الزاخر بالسماح للباحثين بالتحقيق في المساهمة النسبية للمضيف، والعوامل الجرثومية والبيئية على H. pylori العدوى والمرض نتيجة6. سبق وقد أثبتت الدراسات أن تطول H. pylori عدوى فئران على نتائج الخلفية الوراثية C57BL/6 في تطوير التهاب المعدة المزمن وغده ضمور، كلا من السمات المميزة ل عدوى H. pylori 7. وعلاوة على ذلك، قد تبين الإصابة بالأنواع البكتيرية القطط/الكلاب ذات الصلة، حطي حاء، للحث على تشكيل الشعير في الفئران مع أمراض مماثلة وتطور المرض كما رأينا في لمفوما مالت البشرية8،9. H. pylori الأكثر استخداماً هو عزل في دراسات الاستعمار الماوس “سيدني سلالة 1” (SS1) سلالة10الذي كاجالباي+ ولكن من T4SS غير وظيفية (T4SS)11. السلالات الأخرى المستخدمة على نطاق واسع تشمل H. pylori B128 7.13 (كاجالباي+/T4SS+)12 و X47-2AL (cagPAI/T4SS)13. للالتهابات حطي حاء ، سلالة CS1 (“القط دوامة 1″، كاجالباي/T4SS) هو عموما يستخدم14.

وهنا، نحن نقدم بروتوكول وصف إعداد لقاح الملوية للعدوى في الجسم الحي ، والإجراءات المتعلقة بإجراء تزقيمية الفئران، فضلا عن أساليب لمعالجة الأنسجة لدراسة التغيرات التشريحية المرضية في المعدة. على وجه الخصوص، هذه المادة سوف تركز على غذائها الأساليب المستخدمة لتصور الاستعمار الجرثومي وتقييم التغيرات التشريحية المرضية، بما في ذلك تشكيل الشعير، وفي الغشاء المخاطي المعدة من الفئران المصابة. قد تكون بعض الأساليب الموصوفة هنا تتكيف مع دراسة أخرى مسببات أمراض الأمعاء مثل س. تيفيموريوم أو C. رودينتيوم.

Protocol

1-النمو وإعداد لقاح البكتيريا ذوبان الجليد الأرصدة والغليسيرول H. pylori أو H. حطي15 -80 درجة مئوية وثقافة فرعية على الحصان أجار الدم (HBA) لوحات تضم: “أجار الدم قاعدة رقم 2” (انظر الجدول للمواد)؛ تعديل “الملحق سكيرو انتقائية المضادات الحيوية” (تتألف من فانكومايسي?…

Representative Results

ويصف هذا البروتوكول أسلوب تزقيمية شفوي لتحقيق إجراء عدوى H. pylori أو H. حطي في نماذج الماوس مورين (الشكل 1). في أعقاب القتل الرحيم، يتم إزالة بطون، ووزنه ومقسمة إلى نصفين تساوي 2 تتألف من التجويف والجسم ومناطق غير غدي من أنسجة المعدة (الشكل 2). تتم إزالة ا…

Discussion

ويصف هذا البروتوكول استخدام طراز الماوس في فيفو لعدوى الملوية . الخطوات الحاسمة من الإجراءات: 1) إعداد لقاح الملوية التي تحتوي على البكتيريا قادرة على البقاء ومتحركة؛ 2) تسليم الأرقام المناسبة للبكتيريا للماوس عبر إجراء تزقيمية مدتها؛ 3) الكشف عن العدوى البكتيرية بالعد مستعم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يشكر السيدة أ دي Paoli والسيدة جورجي رأي-ماكان للمساعدة التقنية. الكتاب تقر استخدام التسهيلات والمساعدة التقنية من منصة موناش علم الأنسجة وقسم علم التشريح وعلم الأحياء التنموي، جامعة موناش. المختبر هو مدعومة بتمويل من “الوطنية للصحة” ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) إلى RLF (APP1079930، APP1107930). ويدعم RLF “زمالة للبحث أقدم” من NHMRC (APP1079904). دينار كويتي ومولودية تدعمها سواء في “موناش الدراسات العليا المنح الدراسية”. دينار كويتي أيضا معتمد من قبل المركز للحصانة الفطرية والأمراض المعدية، ومعهد هدسون للأبحاث الطبية، في حين MC “المنح الدراسية الدولية بعد التخرج” من كلية الطب والتمريض والعلوم الصحية، جامعة موناش. أبحاث في “معهد هدسون للأبحاث الطبية” معتمد من قبل “التنفيذية برنامج الحكومة الفيكتوري دعم البنية التحتية”.

Materials

Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2 Thermo Fischer Scientific CM0271B Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood Australian Ethical Biologicals PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth BD Bioscience 237500 Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs Thermo Fischer Scientific CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured ChemSupply AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol) Merck 100995
Xylene (sulphur free) ChemSupply XT003-20L
Mayer's Haematoxylin Amber Scientific  MH-1L Filter before use
Eosin, Aqueous Stain Amber Scientific EOCA-1L Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified Sigma Aldrich WG80-2.5L Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene Grale Scientific 11031/5
DPX mounting medium VWR 1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fischer Scientific Q32850
Oligonucleotides Sigma Aldrich The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega  M8291 Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs Bioline BIO-39028 Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose Bioline BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate Univar (Ajax Fine Chemicals) A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate Chem-Supply MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin Sigma Aldrich V2002-1G Dissolve in deionized water
Polymyxin B Sigma Aldrich P4932-5MU Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC) Sigma Aldrich T7883 Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin Amresco (Astral Scientific) E437-100MG Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis Sigma Aldrich B0125 Dissolve in deionized water
Naladixic acid Sigma Aldrich N8878 Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox) Medical Developments International Not applicable
Paraffin Wax Paraplast Plus, Leica Biosystems 39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars Thermo Fischer Scientific HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes Interpath Services 200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C
23g precision glide needle BD Bioscience 301805
Parafilm M Bemis, VWR PM996
Portex fine bore polythene tubing Smiths Medical 800/100/200
Plastic feeding catheters Instech  Laboratories FTP20-30
1 ml tuberculin luer slip disposable syringes BD Bioscience 302100
Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes Sigma Aldrich Z317314 Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap) Miltenyi Biotec 30-093-236
 Qubit Fluorometer Thermo Fischer Scientific Q33216
Sterile plastic loop LabServ LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System Leica Biosystems Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 Sakura, Alphen aan den Rijn 4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System Sakura, Alphen aan den Rijn 4170
Microtome, Leica RM2235 Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific 4951PLUS4

References

  1. Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
  2. Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
  3. Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
  4. Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
  5. Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
  6. O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
  7. Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
  8. Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
  9. Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
  10. Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
  11. Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
  12. Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
  13. Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
  14. Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
  15. Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
  16. Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
  17. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  18. Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
  19. Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
  20. Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
  21. Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
  22. Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
  23. Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
  24. Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
  25. Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
  26. Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
  27. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
  28. Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
  29. Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
  30. Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
  31. Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).

Play Video

Cite This Article
D’Costa, K., Chonwerawong, M., Tran, L. S., Ferrero, R. L. Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies. J. Vis. Exp. (140), e56985, doi:10.3791/56985 (2018).

View Video