Summary

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

Published: October 18, 2018
doi:

Summary

עכברים מייצגים מודל לא בפז ויוו ללמוד זיהום מחלות הנגרמות על ידי מיקרואורגניזמים במערכת העיכול. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות ללימוד מושבת חיידקים ושינויים histopathological העכבר מודלים של הליקובקטר פילורי-הקשורים למחלה.

Abstract

הליקובקטר פילורי הוא. חיידק קיבה נוכח חצי מהאוכלוסייה הכללית, היא הגורם המשמעותי התחלואה והתמותה בבני אדם. מספר מודלים העכבר של זיהום הליקובקטר בקיבה פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הסלולר לפיה ח פילורי חיידקים ליישב את הבטן של בני-אדם כפונדקאים, לגרום למחלות. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקולים: 1) להתכונן המתלים חיידקי הזיהום ויוו של עכברים ויה intragastric gavage; 2) לקבוע את רמות מושבת חיידקים ברקמות קיבה העכבר, על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) וספירת קיימא; ו 3) להעריך שינויים פתולוגיים, מאת היסטולוגיה. כדי ליצור Helicobacter זיהום בעכברים, חיות (SPF) ללא פתוגן מסוים קודם מחוסנים עם המתלים (מכיל ≥ 105 המושבה יוצרי יחידות, CFUs) של העכבר-להמדינות זני גם הליקובקטר פילורי או אחרים spp. הליקובקטר בקיבה של חיות, כגון הליקובקטר חתול. -זיהום שלאחר זמן מתאים-נקודות, קיבות טוחנות, גזור sagittally לתוך רקמות שווה שני קטעים, אחד המרכיבים את האזורים antrum וגוף. אחד של קטעים אלה משמש לאחר מכן או ספירה מעשית או הפקת דנ א, ואילו השני הוא נתון לעיבוד היסטולוגית. מושבת חיידקים ושינויים histopathological בבטן עשויים להידרש באופן שגרתי בסעיפים רקמת קיבה מוכתם Warthin-כוכביים, Giemsa או Haematoxylin, אאוזין (H & E) כתמים, לפי הצורך. ניתוחים נוספים אימונולוגי עשוי להתבצע גם על ידי אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence על העכבר רקמת קיבה חלקים. הפרוטוקולים המתוארים להלן נועדו במיוחד כדי לאפשר את ההערכה בעכברים של פתולוגיות קיבה דמוי אלה הקשורות האדם ח פילורי מחלות, כולל דלקת, ניוון בלוטת הלימפה זקיק היווצרות. Inoculum הכנה והפרוטוקולים intragastric gavage עשוי גם להיות מותאם ללמוד בפתוגנזה של אחרים המעית האנושי גורמי מחלה לישוב עכברים, כגון סלמונלה Typhimurium או Citrobacter rodentium.

Introduction

הליקובקטר פילורי הוא. בצורת ספירלה, גראם שליליים, אנושי קיבה חיידק נוכח כל האוכלוסיות ברחבי העולם, עם זיהום המחירים במדינות מתפתחות מוערך לפי 80%1. למרות שרוב ח פילורי-אנשים נגועים הם אסימפטומטיים, יש לפתח מחלות חמורות יותר, ועד סרטן קיבה2כיב פפטי. ח פילורי-סרטן הקשורים בהרחבה מאופיינים על-ידי שינויים ממאירים בתאי אפיתל (GECs) או היווצרות של רקמות הלימפה קטרי במיוחד בבטן, וכתוצאה מכך אדנוקרצינומה קיבה או רירית הקשורים הלימפה לימפומה רקמות (מאלט), בהתאמה. ח פילורי מותאמת במיוחד כדי לשרוד גומחה אקולוגית קשה של הקיבה בשל נוכחותם של הגורמים התקפה אלימה ומנגנונים שונים להקל על הדבקות שלה, גדילה וחילוף החומרים במקצוע הזה. בפרט, ארסית זני ה פילורי להחזיק את 40 kb חטיבתי פתוגניות איילנד (חטיבתיפאי) מקודד כ 30 גנים הדרושים לייצור סוג 4 הפרשת מערכת (T4SS)3,4 . חטיבתי פאי-חיוביות ח פילורי זנים משויכים אינדוקציה של רמות גבוהות של דלקת כרונית במארח, אשר היה מעורב כמו קודמן חיוני של אדנוקרצינומה קיבה5.

In vivo מודלים בעלי חיים, במיוחד עכברים, היה מאוד אינפורמטיבי על ידי ומאפשר לחוקרים לחקור את התרומה של המארח, גורמים חיידקי וסביבתיים על ה פילורי זיהום, מחלת התוצאה6. מחקרים בעבר הראו כי ממושך ח פילורי זיהום של עכברים על הרקע הגנטי C57BL/6 תוצאות בפיתוח של גסטריטיס כרונית של בלוטת להתנוון, שניהם ההיכר של ה פילורי זיהום7. יתר על כן, זיהום עם המין חיידקי קשורים חתולים/כלב, חתול ה’, הוכח כדי לעודד היווצרות מאלט בעכברים עם התקדמות המחלה כפי שניתן לראות ב-8,לימפומה מאלט האנושי9מחלות דומות. הנפוץ ביותר בשימוש ח פילורי בידוד במחקרים קולוניזציה העכבר הוא “סידני המתח 1” (SS1) זן10, אשר חטיבתיפאי+ אך יש של T4SS שאינם פונקציונליים (T4SS)11. זנים אחרים בשימוש נרחב כוללים ח פילורי B128 7.13 (חטיבתיפאי+/T4SS+)12 ו- X47-2AL (חטיבתיפאי/T4SS)13. ה חתול זיהומים, המתח CS1 (“החתול ספירלה 1”, חטיבתיפאי/T4SS) נמצא בשימוש בדרך כלל14.

במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את הכנת הליקובקטר inocula ויוו זיהום, נוהל gavage intragastric של עכברים, כמו גם שיטות עיבוד רקמות לחקר שינויים histopathological בבטן. בפרט, מאמר זה יתמקד השיטות היסטולוגית נהגו להמחיש מושבת חיידקים להעריך שינויים histopathological, כולל היווצרות מאלט, רירית קיבה של עכברים נגועים. חלק מהשיטות המתוארות כאן עשוי להיות מותאם לחדר העבודה של פתוגנים במעיים אחרים כגון ס Typhimurium או rodentium ג.

Protocol

1. צמיחה והכנה של חיידקי Inocula הפשרת גליצרול המלאי של ה פילורי או חתול ה15 מ-80 מעלות צלזיוס ו תת-תרבות על פלטות אגר דם (HBA) סוס הכוללת: אגר דם בסיס מס ‘ 2 (ראה טבלה של חומרים); ששונה “אנטיביוטי בררני תוספת של Skirrow” (המורכב ואנקומיצין, 10 μg/mL; polymyxin B, ננוגרם למ”ל 25; וטר…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר שיטת gavage דרך הפה כדי להשיג זיהום intragastric עם ה פילורי או ה חתול עכבר מאתר דגמים (איור 1). לאחר המתת חסד, קיבות הוסר, שקל, מחולק ל 2 חצאים שווים הכוללת את antrum, הגוף ואזורים שאינם הבלוטות של רקמות הקיבה (איור 2). האזור הלא-הבלוטות מוסר לפני ב?…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מודל העכבר ויוו זיהום הליקובקטר . השלבים הקריטיים של ההליך הם: 1) הכנת הליקובקטר inocula המכיל חיידקים קיימא תאי; 2) משלוח של המספרים המתאימים של חיידקים העכבר באמצעות intragastric gavage; 3) גילוי של זיהום חיידקי המושבה סופר ו/או PCR; . ו-4) עיבוד של רקמות הקיבה כדי לא…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות גב’ א דה פאולי, גב’ ג’ורג’י. ריי מקאן לקבלת סיוע טכני. המחברים להכיר השימוש במתקני וסיוע טכני של פלטפורמה היסטולוגיה מונש, המחלקה של האנטומיה, ביולוגיה התפתחותית, אוניברסיטת מונש. המעבדה נתמך על ידי מימון הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) רוזה לוקסמבורג (APP1079930, APP1107930). רוזה לוקסמבורג נתמך על ידי מלגת מחקר בכיר מ NHMRC (APP1079904). KD ו- MC שניהם נתמכים על ידי מונש מלגות לתואר שני. KD נתמך גם על ידי המרכז מולדת חסינות, זיהומיות מחלות, מכון הדסון למחקר רפואי, בעוד MC יש מלגת לתארים מתקדמים הבינלאומי מן הפקולטה לרפואה, לסיעוד למדעי הבריאות, אוניברסיטת מונש. מחקר על הדסון המכון של המחקר הרפואי נתמך על ידי תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני.

Materials

Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2 Thermo Fischer Scientific CM0271B Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood Australian Ethical Biologicals PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth BD Bioscience 237500 Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs Thermo Fischer Scientific CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured ChemSupply AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol) Merck 100995
Xylene (sulphur free) ChemSupply XT003-20L
Mayer's Haematoxylin Amber Scientific  MH-1L Filter before use
Eosin, Aqueous Stain Amber Scientific EOCA-1L Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified Sigma Aldrich WG80-2.5L Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene Grale Scientific 11031/5
DPX mounting medium VWR 1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit Thermo Fischer Scientific Q32850
Oligonucleotides Sigma Aldrich The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega  M8291 Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs Bioline BIO-39028 Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose Bioline BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate Univar (Ajax Fine Chemicals) A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate Chem-Supply MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin Sigma Aldrich V2002-1G Dissolve in deionized water
Polymyxin B Sigma Aldrich P4932-5MU Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC) Sigma Aldrich T7883 Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin Amresco (Astral Scientific) E437-100MG Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis Sigma Aldrich B0125 Dissolve in deionized water
Naladixic acid Sigma Aldrich N8878 Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox) Medical Developments International Not applicable
Paraffin Wax Paraplast Plus, Leica Biosystems 39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars Thermo Fischer Scientific HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes Interpath Services 200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C
23g precision glide needle BD Bioscience 301805
Parafilm M Bemis, VWR PM996
Portex fine bore polythene tubing Smiths Medical 800/100/200
Plastic feeding catheters Instech  Laboratories FTP20-30
1 ml tuberculin luer slip disposable syringes BD Bioscience 302100
Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes Sigma Aldrich Z317314 Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap) Miltenyi Biotec 30-093-236
 Qubit Fluorometer Thermo Fischer Scientific Q33216
Sterile plastic loop LabServ LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System Leica Biosystems Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 Sakura, Alphen aan den Rijn 4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System Sakura, Alphen aan den Rijn 4170
Microtome, Leica RM2235 Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific 4951PLUS4

References

  1. Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
  2. Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
  3. Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
  4. Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
  5. Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
  6. O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
  7. Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
  8. Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
  9. Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
  10. Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
  11. Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
  12. Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
  13. Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
  14. Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
  15. Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
  16. Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
  17. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  18. Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
  19. Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
  20. Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
  21. Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
  22. Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
  23. Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
  24. Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
  25. Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
  26. Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
  27. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
  28. Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
  29. Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
  30. Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
  31. Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).

Play Video

Cite This Article
D’Costa, K., Chonwerawong, M., Tran, L. S., Ferrero, R. L. Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies. J. Vis. Exp. (140), e56985, doi:10.3791/56985 (2018).

View Video