Получение высококачественных геномной ДНК опухолевых тканей является важным первым шагом для анализа генетических изменений, с помощью следующего поколения последовательности. В этой статье мы представляем простой и быстрый способ обогатить опухолевых клеток и получить нетронутыми ДНК от прикосновения отпечаток цитологии образцов.
Важно, чтобы определить мутационного статуса в рак до администрации и лечения конкретных молекулярной целевых препаратов для больных раком. В клинических условиях, формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE) широко используются для генетического тестирования. Однако FFPE ДНК как правило повреждено и фрагментарный характер во время процесса фиксации с формалином. Таким образом FFPE ДНК иногда не достаточно для генетического тестирования из-за низкого качества и количества ДНК. Здесь мы представляем метод касания отпечаток цитологии (ИТК) для получения геномной ДНК от раковых клеток, которые можно наблюдать под микроскопом. Морфология и рак клеток числа клеток может оцениваться с помощью образцов TIC. Кроме того добыча геномной ДНК из TIC образцов может быть завершена в течение двух дней. Общее количество и качество TIC ДНК, полученные с помощью этого метода была выше, чем FFPE ДНК. Это быстрый и простой метод позволяет исследователям для получения высокого качества ДНК генетического тестирования (например, следующего поколения последовательности анализа, цифровой ПЦР и Количественная ПЦР в реальном времени) и сократить сроки для представления результатов.
Следующее поколение технологии виртуализации предоставил исследователи значительных достижений в анализе генома информации в генетических вариаций и Менделевское болезни, наследственная предрасположенность, рака 1,2,3 . Атлас генома рака (TCGA) и международного консорциума рака генома (ICGC) проводил выявление генетических изменений в нескольких типов общих рака4. Сотни основных Рак генов драйвера были успешно выявлены, и некоторые из этих молекул предназначены для наркотиков развития1,5,6.
В клинических условиях, образцы FFPE часто используются для диагностики патологических и молекулярных тестирования для различных заболеваний, включая рак. Однако во время процесса фиксации с формалином, ДНК белковых или ДНК-ДНК cross-linking возникает и фрагментацию ДНК индуцируется. Таким образом образцы ДНК FFPE не всегда подходит для генетического анализа из-за низкого качества и количества ДНК7,8,9. Кроме того она занимает несколько дней, чтобы подготовить FFPE образцы, и технические навыки необходимо подготовить точно в разделах. Таким образом желательно разработать простой и быстрый метод для получения высокого качества нетронутыми ДНК.
Цитология является альтернативный метод для диагностики патологии. Цитологические пробоподготовки является более простой, менее дорогим и более быстрый подход по сравнению с FFPE подготовка10. ТИЦ техника была выполнена на дозорных лимфатические узлы и маргинальных тканей от больных раком молочной железы для интраоперационного быстрой диагностики для11,несколько лет12. Однако есть несколько докладов, которые изучили ли высокое качество геномной ДНК могут быть извлечены из образцов ТИЦ и используется для последующего генетического анализа. Цитологические образцов обычно окрашивали Папаниколау (Пап) или окрашивание Гимза, и мы ранее сообщали, что количество и качество ДНК, извлеченные из образцов TIC (особенно пятнами Гимза образцы) превосходят образцы, полученные из FFPE 13тканей. По сравнению с Pap окрашивание, Гимзы окрашивание имеет преимущество в требующих менее окрашивание процедур. В Пап окрашивание, после того, как образцы были исправлены и витражи, они должны устанавливаться с монтажными среднего (например, Malinol) для разграничения содержимое образца, например клетки тумора, нормальные клетки и воспалительных клеток под микроскопом. Если ППА образец подготовлен без монтажа шаг, это почти невозможно наблюдать клетки под микроскопом, потому что высушенный образец. В сравнении Гимзы окрашивания можно наблюдать в состояние сушеных, поэтому монтаж шаг не является необходимым для быстрой сотовой оценки. Для microdissection Гимзы окрашивание является более подходящим, потому что он требует сухих образцов.
В настоящем докладе мы представляем простой и быстрый метод для подготовки TIC образцов с Гимза окрашивание и продемонстрировать, что ТИЦ является лучшим источником для ДНК, по сравнению с FFPE образцами.
В этом исследовании мы представили альтернативный метод для получения опухоли ДНК от клинических патологических образцов, используя TIC. ТИЦ подготовка очень проста и требует меньше времени по сравнению с FFPE методами, без требования для специальных инструментов10. Все проц?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всех медицинских и вспомогательных сотрудников больницы и пациентов за согласие участвовать. Мы благодарим Габриэль белый волк, PhD, Edanz группы (www.edanzediting.com/ac) для редактирования проекта настоящего доклада. Это исследование было поддержано субсидий для исследовательского проекта генома из префектуры Яманаси (Y.H. и М.О) и Грант от ЯСУДА медицинский фонд (Y.H.).
FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
Pincette | NATSUME | A-5 | |
1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |