קבלת דנ א גנומי באיכות גבוהה רקמות הגידול, מהווה צעד ראשון חיוני לניתוח שינויים גנטיים באמצעות רצף הדור הבא. במאמר זה, נציג שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג שלמות הדנ א של מגע ההטבעה ציטולוגיה דגימות ולהעשיר תאים סרטניים.
זה חיוני כדי לקבוע את מצב mutational בסרטן לפני ניהול וטיפול בתרופות ספציפיות יישוב מולקולרית לחולי סרטן. בהגדרה קלינית, פורמלין-תיקון רקמות (FFPE) פרפין-מוטבע נמצאים בשימוש נרחב עבור בדיקה גנטית. עם זאת, FFPE DNA בדרך כלל פגום, מקוטעת במהלך תהליך פיקסציה עם פורמלין. לכן, FFPE DNA היא לפעמים לא נאותה בדיקות גנטיות עקב איכות נמוכה והן את כמות ה-DNA. כאן אנו מציגים שיטת מגע ההטבעה ציטולוגיה (טיק) להשיג DNA גנומי תאים סרטניים, אשר יכול להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ. מספרי הטלפון הנייד מורפולוגיה, סרטן תאים שניתן להעריך באמצעות דגימות טיק. יתר על כן, הפקת דנ א גנומי מדגימות טיק יכולה להסתיים בתוך יומיים. הסכום הכולל ואיכות DNA טיק שהושג באמצעות שיטה זו הייתה גבוהה יותר מזו של ה-DNA FFPE. שיטה זו מהירה ופשוטה מאפשרת לחוקרים להשיג DNA באיכות גבוהה עבור בדיקות גנטיות (למשלניתוח רצף של הדור הבא, ה-PCR דיגיטלי, בזמן אמת כמותיים PCR), כדי לקצר את משך העבודה על דיווח תוצאות.
הדור הבא רצפי טכנולוגיה סיפקה החוקרים התקדמות משמעותית ניתוח הגנום מידע וריאציות גנטיות, מחלות Mendelian, נטייה תורשתית ו סרטן 1,2,3 . סרטן הגנום אטלס (TCGA) של קונסורציום גנום הסרטן הבינלאומי (ICGC) רדף את הזיהוי של שינויים גנטיים של מספר סוגי סרטן נפוצים4. מאות סרטן חיוני הנהג גנים זוהו בהצלחה ולאחר כמה מולקולות אלה מיועדים עבור סמים פיתוח1,5,6.
בהגדרה קלינית, דגימות FFPE משמשים אבחנה פתולוגית ולבדיקה מולקולריות למחלות שונות, כולל סרטן. אולם, במהלך תהליך פיקסציה עם פורמלין, חלבון-דנ א או DNA-DNA cross-linking מתרחש, פיצול הדנ א הוא המושרה. לפיכך, דגימות די אן איי FFPE אינם תמיד מתאימים לבדיקה גנטית עקב איכות נמוכה והן את כמות ה-DNA-7,–8,–9. בנוסף, לוקח מספר ימים כדי להכין דגימות FFPE, מיומנות טכנית יש צורך להכין במדויק את הסעיפים. לכן, רצוי לפתח שיטה פשוטה ומהירה להשגת DNA ללא פגע באיכות גבוהה.
ציטולוגיה היא שיטה אלטרנטיבית לאבחון פתולוגי. הכנת הדוגמא cytological הוא פשוט יותר, פחות גישה יקר, מהירה יותר לעומת הכנה FFPE10. הטכניקה טיק בוצע נטור הלימפה וברקמות שולית של חולי סרטן השד לאבחון מהיר פוסט11,כמה שנים12. עם זאת, ישנם דיווחים מעטים יש בחן אם הדנ א הגנומי באיכות גבוהה יכול להיות מופק דגימות טיק, ומשמש לצורך ניתוח גנטי מאוחר יותר. דגימות cytological בדרך כלל מוכתמים פאפאניקולאו (Pap) או צביעת Giemsa ולאחר בעבר דיווחנו כי כמות ואיכות DNA מופק טיק דגימות (במיוחד שהוכתמו Giemsa דגימות) נעלים על דגימות המתקבל FFPE רקמות13. לעומת Pap מכתים, צביעת Giemsa יש יתרון שאינו דורש פחות הליכים מוכתמים. ב- Pap מכתים, לאחר הדגימות קבוע, צבעונית, הם חייב להיות מותקן עם הרכבה בינונית (למשל, Malinol) להבחנה בין דגימת תוכן, כגון תאים סרטניים, תאים נורמליים ותאים דלקתיים תחת מיקרוסקופ. אם הדגימה Pap מוכן ללא השלב הרכבה, זה כמעט בלתי אפשרי לקיים את התאים במיקרוסקופ כי הדגימה הוא מיובש. לשם השוואה, צביעת Giemsa יכול להיות שנצפו במדינה מיובשים, לכן, הצעד הרכבה אינו נחוץ לצורך הערכה סלולרית מהירה. עבור microdissection, צביעת Giemsa הוא מתאים יותר כי זה דורש דגימות יבש.
בדו ח זה, אנו להציג שיטה פשוטה ומהירה להכנת דגימות טיק עם צביעת Giemsa, להדגים כי טיק הוא מקור טוב יותר עבור ה-DNA לעומת דגימות FFPE.
במחקר זה, הצגנו שיטה חלופית להשגת גידול הדנ א של דגימות פתולוגיים קליניים באמצעות טיק. טיק ההכנה היא פשוטה מאוד וזקוק בפחות זמן לעומת שיטות FFPE, ללא הדרישה מכשירים מיוחדים10. כל ההליכים משלב הכנת טיק כדי מיצוי הדנ א יכולה להסתיים בתוך יומיים (איור 1). שיטה זו ובכך מ…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים כל הצוות הרפואי ואת נלווים של החולים ושל המטופלים על מסכים להשתתף. אנו מודים גבריאל לבן וולף, PhD, מקבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) עבור עריכת טיוטה של דו ח זה. מחקר זה נתמך על ידי מענק הסיוע פרויקט מחקר הגנום של פריפקטורה של יאמאנאשי (י. ח, שיטת הפעולה), מענק מ של יאסאדה רפואי קרן (י. ח).
FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
Pincette | NATSUME | A-5 | |
1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |