الحصول على جودة عالية المجينية الحمض النووي من أنسجة الورم خطوة أولى أساسية لتحليل التعديلات الوراثية باستخدام تسلسل الجيل القادم. في هذه المقالة، نحن نقدم طريقة بسيطة وسريعة لإثراء الخلايا السرطانية والحصول على الحمض النووي سليمة من لمس بصمة عنق العينات.
من المهم تحديد حالة حيث في السرطان قبل الإدارة والعلاج العقاقير المستهدفة جزيئية محددة لمرضى السرطان. في الإعداد السريرية، الفورمالين–الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة (FFPE) تستخدم على نطاق واسع للاختبارات الجينية. ومع ذلك، FFPE الحمض النووي عموما أضرار ومجزأة أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين. ولذلك، “فب الحمض النووي” ليس أحياناً كافية للاختبارات الجينية بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي. هنا نقدم طريقة للمس بصمة علم الخلايا (عرة) للحصول على الحمض النووي من الخلايا السرطانية، التي يمكن ملاحظتها تحت مجهر. يمكن تقييم أرقام الخلية مورفولوجيا وسرطان الخلية باستخدام عينات عرة. وعلاوة على ذلك، استخراج الحمض النووي من عينات التشنج يمكن أن تكتمل في غضون يومين. وكان إجمالي كمية ونوعية من “عرة الحمض النووي” التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب أعلى من “الحمض النووي فب”. يسمح هذا الأسلوب السريع والبسيط الباحثين للحصول على الحمض النووي عالي الجودة للاختبارات الجينية (مثلتحليل تسلسل الجيل القادم، بكر الرقمية والوقت الحقيقي الكمي PCR) وتقصير المدة اللازمة للإبلاغ عن النتائج.
الجيل القادم تكنولوجيا التسلسل وقدم الباحثون أوجه التقدم الكبير في تحليل المعلومات الجينوم في الاختلافات الوراثية والأمراض مندلية والاستعداد الوراثي والسرطان 1،2،3 . أطلس جينوم السرطان (تكجا)، واتحاد جينوم السرطان الدولية (إيكجك) اتبعت تحديد التعديلات الوراثية في عدة أنواع من السرطانات الشائعة4. مئات جينات سائق السرطان الأساسية قد حددت بنجاح، وبعض هذه الجزيئات مستهدفون للمخدرات التنمية1،،من56.
في الإعداد السريرية، يشيع استخدام العينات FFPE المرضية التشخيص والاختبارات الجزيئية للأمراض المختلفة، بما في ذلك السرطان. ومع ذلك، أثناء عملية التثبيت مع الفورمالين، البروتين الحمض النووي أو الحمض الخلوي الصبغي DNA العابرة للربط يحدث وفعل تجزؤ الحمض النووي. وهكذا، عينات من “الحمض النووي فب” ليست دائماً مناسبة للتحليل الجيني بسبب تدني نوعية وكمية من الحمض النووي7،،من89. بالإضافة إلى ذلك، يستغرق عدة أيام لإعداد العينات فب، والمهارة التقنية اللازمة لإعداد دقة المقاطع. لذلك، من المستحسن لتطوير طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية سليمة الحمض النووي.
علم الخلايا طريقة بديلة لتشخيص المرضية. إعداد عينة الخلوية أبسط، أقل النهج باهظة الثمن، وأكثر سرعة بالمقارنة مع إعداد فب10. وقد أجريت تقنية تيك على الحارس الغدد الليمفاوية والأنسجة هامشية من مرضى سرطان الثدي للمضاعفات التشخيص السريع لبعض السنوات11،12. ومع ذلك، هناك عدد قليل من التقارير التي درست ما إذا كان يمكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة من العينات عرة، وتستخدم للتحليل الجيني اللاحقة. عينات الخلوية عادة ملطخة بابانيكولاو (Pap) أو تلطيخ جيمسى، وكنا ذكرت سابقا أن كمية ونوعية من الحمض النووي المستخرج من عينات عرة (لا سيما العينات الملطخة جيمسى) تعلو على العينات التي تم الحصول عليها من فب 13من الأنسجة. وبالمقارنة مع تلطيخ Pap، تلطيخ Giemsa لديه ميزة التي تتطلب إجراءات المصبوغة أقل. في تلطيخ Pap، بعد أن تم إصلاح العينات والملون، يجب تحميل مع تصاعد المتوسطة (مثلاً، مالينول) للتمييز بين محتويات نموذج، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية والخلايا الملتهبة تحت مجهر. إذا كانت العينة Pap مستعدة دون خطوة متصاعدة، من المستحيل تقريبا لمراقبة الخلايا تحت مجهر لأن العينة هو المجففة. وبالمقارنة، تلطيخ Giemsa يمكن ملاحظتها في الدولة المجففة، ولذلك الخطوة تصاعد ليس ضروريا للتقييم السريع الخلوية. ميكروديسيكشن، جيمسى تلطيخ أكثر ملاءمة لأنها تتطلب العينات الجافة.
في هذا التقرير، علينا الأخذ بطريقة بسيطة وسريعة لإعداد العينات التشنج مع تلطيخ Giemsa وتثبت أن التشنج أفضل مصدر للحمض النووي مقارنة مع العينات فب.
في هذه الدراسة، وقد عرضنا طريقة بديلة للحصول على الورم الحمض النووي من العينات المرضية السريرية استخدام عرة. إعداد عرة بسيطة جداً وتحتاج إلى وقت أقل بالمقارنة مع أساليب فب، دون الحاجة إلى أدوات خاصة10. يمكن إكمال كافة الإجراءات من إعداد عرة لاستخراج الحمض النووي في غضون يومين …
The authors have nothing to disclose.
ونشكر جميع الموظفين الطبية والتبعية للمستشفى والمرضى لموافقتها على المشاركة. ونحن نشكر “غابرييل الأبيض وولف”، دكتوراه، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة لهذا التقرير. وأيد هذه الدراسة معونات “مشروع بحوث الجينوم” من محافظة ياماناشي (أي إتش ومو) ومنحة من ياسودا الطبية مؤسسة (أي إتش).
FINE FROST white20 micro slide glass | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
Cyto Quick A solution | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
Cyto Quick B solution | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
Giemsa solution | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
QIAamp DNA FFPE tissue kit | Qiagen | 56404 | |
TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
TaqMan RNase P Detection Reagents Kit | Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
TaqMan Assay from FFPE DNA QC Assay v2 | Thermo Fisher Scientific | 4324034 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
MicroAmp optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4480442 | |
Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit | Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
Ion PGM Hi-Q View Sequencing Kit (200 base) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
Veriti 96-well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
16-position Magnetic Stand | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL (Low binding tube) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
MicroAmp™ Optical 96-well Reaction Plates | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
MicroAmp™ Clear Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
Agencourt™ AMPure™ XP Kit | Beckman Coulter | A63881 | |
Ethanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
Sodium hydroxide (10M) | Sigma | 72068 | |
DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrifuge |
petit-incubator | WAKEN | WKN-2290 | Air incubator |
SensiCare Powder-free Nitrile Exam Gloves | MEDLINE | SEM486802 | |
Sterile gauze | Osaki | 11138 | |
Refrigerator MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Vortex mixer |
Pincette | NATSUME | A-5 | |
1.5 mL microtube | BIOBIK | RC-0150 |