Estudos de longo prazo são essenciais para a compreensão do processo de evolução e os mecanismos de adaptação. Em geral, estes estudos requerem compromissos para além do tempo de vida dos pesquisadores. Aqui, um poderoso método é descrito que avança dramaticamente a coleta de dados do estado-da-arte para gerar dados longitudinais em sistemas naturais.
Estudos de longo prazo permitem a identificação de processos eco-evolutivos que ocorrem durante períodos de tempo prolongado. Além disso, eles fornecem a chaves dados empíricos que podem ser utilizados em modelagem preditiva para previsão de respostas evolutivas dos ecossistemas naturais para futuras mudanças ambientais. No entanto, excluindo alguns casos excepcionais, estudos de longo prazo são escassos devido a dificuldades logísticas associadas acessando amostras temporais. Dinâmica temporal frequentemente é estudada no laboratório ou em experimentos controlados do mesocosmo com estudos excepcionais que reconstruir a evolução de populações naturais em estado selvagem.
Aqui, um procedimento operacional padrão (SOP) é fornecido para reviver ou ressuscitar dormente Daphnia magna, uma espécie de pedra angular do zooplâncton generalizada nos ecossistemas aquáticos, para avançar dramaticamente a coleta de dados longitudinais de estado-da-arte em sistemas naturais. O campo da ecologia da ressurreição foi definido em 1999 por Kerfoot e colegas de trabalho, mesmo que a primeira tentativa de incubação diapausing zooplâncton ovos datam do final dos anos 1980. Desde papel seminal do Kerfoot, a metodologia de ressuscitar espécies de zooplâncton foi cada vez mais frequentemente aplicada, embora propagado entre laboratórios somente via transferência de conhecimento directo. Aqui, um SOP é descrito que fornece um protocolo passo a passo sobre a prática de ressuscitar dormente Daphnia magna ovos.
Dois principais estudos são fornecidos em que a resposta de aptidão do Ressuscitado populações de Daphnia magna para aquecimento é medido, capitalizando sobre a capacidade de estudar populações históricas e modernas nas configurações do mesmas. Finalmente, a aplicação de tecnologias de sequenciamento de próxima geração para estágios revividas ou ainda dormentes é discutida. Estas tecnologias fornecem um poder sem precedentes em dissecando os processos e mecanismos da evolução se aplicado a populações que sofreram mudanças na pressão de seleção ao longo do tempo.
Estudos de longo prazo são essenciais para a compreensão de processos ecológicos e evolutivos na natureza e na avaliação como espécie responde e persiste durante mudanças ambientais1. Isso ocorre porque processos eco-evolutivos acontecem em todas as gerações e ocorrem mudanças no ambiente por longo tempo vãos. Além disso, estudos de longo prazo fornecem chaves dados empíricos que melhoram a precisão de modelagem de previsão, a previsão de respostas evolutivas dos ecossistemas naturais para mudanças ambientais2. A precisão desses modelos é fundamental para implementar estratégias de manejo e conservação para preservar a biodiversidade e o ecossistema de serviços.
Excluindo alguns casos excepcionais (por exemplo, os tentilhões de Galápagos Darwin3 e algas4), estudos de longo prazo são em grande parte limitados a espécie com o tempo de geração curto que pode ser propagado no laboratório5,6 , 7 , 8. portanto, os processos que sustentam a dinâmica evolutiva permanecem indescritíveis. Devido a dificuldades logísticas associadas acessando temporais amostras, dados empíricos são estudados com mais frequência em um espaço do que em um contexto temporal e processos eco-evolução temporais são inferidos ou modelados de dados espaciais. Essa abordagem é conhecida como ‘espaço-para-tempo’ substituição9, pelo qual o espaço é adotado como um substituto para estudar a dinâmica de evolução temporal. A principal limitação da substituição da ‘espaço-para-tempo’ é que taxas de adaptação em diferentes escalas espaciais diferem de variação temporal da mesma população; daí, inferências baseadas na substituição de tempo com espaço são tendenciosas10.
Uma poderosa alternativa que permite estudar a dinâmica evolutiva em ecossistemas naturais ao longo do tempo é a análise das alterações ecológicas e genéticas em espécies produzindo estágios dormentes11. Estes estágios dormentes se acumulam de forma estratificada arquivos biológico que podem ser datados com precisão e paleolimnologically caracterizada12,13. Importante, esses estágios dormentes podem ser ressuscitados e usados em experimentos de laboratório, onde sua resposta evolucionária à mudança ambiental pode ser medida diretamente. Populações históricas podem ser competiu contra seus descendentes modernos evoluiu para estudar as alterações de aptidão e a função dos genes, evoluindo em sintonia com a mudança ambiental14,15,16.
Dormentes estágios incluem sementes, cistos, esporos e bancos de ovo. Embora os primeiros estudos sobre ovos dormentes ressuscitada datam do final da década de 198017e um punhado de estudos aplicaram esta técnica no início da década de 199018,19, campo da ecologia da ressurreição foi formalmente estabelecido pelo livro seminal Kerfoot e colaboradores em 1999,20. Esta prática tem sido aplicada principalmente em reconstruções de paleolimnological de espécies de água doce17,21,22. No entanto, um SOP ainda não está disponível. Aqui, uma descrição passo a passo do protocolo ressurreição aplicado a ovos dormentes as espécies de zooplâncton Daphnia magna é fornecida, a partir da amostragem de sedimentos para o estabelecimento de culturas clonais de filhotes. Etapas do SOP que são facilmente transferíveis para outras espécies de Daphnia, bem como as etapas que podem exigir a otimização adicional, são discutidas.
As dáfnias são zooplankters de água doce presentes na maioria dos habitats lóticos23 . Espécies Daphnia são também obrigatórios parthenogens assexuadas ou cíclicas. D. magna é um parthenogen cíclico que reproduz uma relação clonal sob condições ambientais favoráveis24. Quando as condições ambientais se deterioram, ocorre produção masculina e recombinação sexual conduz à formação de ovos fertilizados que entrar em um estado de dormência, protegido contra o meio ambiente por um caso de quitina chamado ephippium. Uma parte desses ovos dormentes eclodem quando retornam de condições ambientais favoráveis. No entanto, uma grande proporção do banco ovo latente nunca tem uma chance para chocar e, portanto, construir arquivos biológicos ao longo do tempo. Estágios dormentes permanecem enterrados no sedimento de lagos e lagoas e podem ser ressuscitados para o estudo da dinâmica evolutiva durante períodos de tempo prolongado. Porque ovos dormentes de d. magna são o resultado de recombinação sexual, eles são uma boa representação da natural diversidade genética das espécies25. Além disso, eles podem ser mantidos através de reprodução clonal em laboratório. Estas características fornecem a vantagem exclusiva de organismos-modelo isogénicas, mantendo a diversidade genética natural.
Dois principais estudos são apresentados para demonstrar as vantagens de comparar diretamente descendentes históricos e modernos da mesma população de d. magna enfrentando a pressão de seleção ambiental ao longo do tempo. D. magna espécimes foram ressuscitados do Lago anel (Dinamarca), um raso (5 m de profundidade; superfície 22 ha) lagoa mista que tem experimentado um aumento na ocorrência de ondas de calor e a temperatura média ao longo do tempo. D. magna (sub) populações foram ressuscitadas ao longo deste gradiente temporal abrangendo 60 anos (1960-2005) e estudou para investigar a resposta evolutiva para o aquecimento da temperatura. No primeiro estudo de uma experiência comum de jardim, mudanças nas características de aptidão-ligada a história de vida foram medidas em resposta ao aumento de temperatura de + 6 ° C, em conformidade com as previsões do Painel Intergovernamental para mudança climática nos próximos 100 anos 26. no segundo estudo, uma experiência do mesocosmo foi usada para medir a capacidade competitiva dos três (sub) populações sob aquecimento. Estas experiências combinadas mostram que na presença de aquecimento como o único estresse, todos os traços da história de vida e as populações mostram um elevado nível de plasticidade em têm habilidades competitivas iguais. Estes achados sugerem que o aquecimento como um esforço único não impõe custos significativos de aptidão, pelo menos na população estudada aqui.
Devido a alta condutividade térmica da água, os ecossistemas de água doce estão em maior risco de perda de biodiversidade de ecossistemas terrestres, em face da global aquecimento34. É, portanto, fundamental para entender a resposta da espécie trapezoide destes ecossistemas e identificar mecanismos para sobreviver o estresse térmico. A compreensão desses mecanismos nos níveis de espécies e a Comunidade pode ajudar a prever como espécie é afetado pelo aquecimento global e como o efeito em espécies individuais cascatas para outros níveis tróficos. Em última análise, compreender mecanismos de respostas para o aquecimento global permite a identificação de estratégias de remediação para mitigar extinções.
Os estudos de caso aqui apresentados mostram que a resposta de d. magna ao aumento de temperatura é comodamente mediada por plasticidade em traços da história de vida e que resposta a aumento de temperatura sozinho não impõe custos de aptidão clara, pelo menos na população estudada aqui. Alta plasticidade em traços da história de vida é suportada pelo não-significativas diferenças em habilidades concorrentes das populações (sub) na presença de aquecimento. No entanto, experimentos de competição mais longo prazo em várias populações podem ser necessários generalizar estas conclusões.
Ressurreição dos estágios dormentes fornece um recurso sem precedentes para estudar os mecanismos de adaptação e trajetórias de evolução de uma espécie através de tempo de10. Espécies de zooplâncton beneficiam de um tempo de geração rápida (cerca de 2 semanas) e a viabilidade dos estágios dormentes, que permite que um antepassado para competir bateres contra seus próprios descendentes, ou evolução que começa a partir de vários Estados últimos ‘ Repetir ‘. Ecologia de ressurreição essencialmente permite que a investigação se um determinado resultado evolucionário é contingent em eventos anteriores. A identificação dos elementos genéticos da evolução é atualmente possível em experimentos de laboratório usando microorganismos para os quais ‘linhas ancestrais’ são congeladas e ressuscitadas para a análise comparativa com seus descendentes evoluídos6. No entanto, uma das principais limitações de trabalhar com organismos de laboratório é que o estado’ ancestral’ é uma linha de base já deslocada. O estudo dos estágios dormentes permite a recolha de amostras de espécimes do tempo anterior a qualquer evento de estresse (por exemplo, condições ambientais intocadas) e medir trajetórias evolutivas de condições ambientais não perturbadas para vários Estados últimos até os tempos modernos. Nos últimos anos, o estudo de polimorfismo de DNA nas fases de zooplâncton ressuscitado ou ainda dormentes forneceu insights importantes sobre últimos processos demográficos e adaptáveis que contribuíram para a composição genética de populações atuais14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. com a maior acessibilidade das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, o genoma e transcriptoma das fases ressuscitados ou ainda dormentes podem ser sequenciados e o tipo e o número de alterações genéticas acumularam em populações a evoluir ao longo o tempo medido.
A ressurreição SOP apresentado aqui tem importantes aplicações no campo da multi-omics em dois níveis. Multi-omics tecnologias podem ser aplicadas aos espécimes ressuscitados, permitindo uma análise exaustiva dos elementos moleculares envolvidos em respostas adaptativas à pressão de seleção ambiental. Além disso, omics tecnologias podem ser aplicadas a congelada mas fases ainda dormentes. Até agora, a aplicação de tecnologias de sequenciamento de alto throughput para descansando estágios tem sido limitada pela exigência de uma grande quantidade de material de entrada. Estas limitações estão sendo levantada37. Com as exigências de redução para entrada de material e progresso em nanofluidics, sequenciamento do genoma inteiro (WGS) agora é possível a partir de tão pouco quanto 1 ng ou alguns pg de material38a começar. O uso de amplificação do genoma inteiro (WGA) e técnicas de amplificação (WTA) toda transcriptoma, permitindo o enriquecimento de DNA e RNA de pequenas quantidades de tecido, revolucionou tanto metagenomics39,40 e o médico pesquisa41. Estas tecnologias aplicadas aos ovos dormente decapsulated permitem a ultrapassagem das limitações associadas a viabilidade dos estágios dormentes e a investigação dos períodos de tempo prolongado (por exemplo, séculos).
A ressurreição de comunidades de invertebrados produzindo descanso fases permite o alinhamento de histórias da Comunidade com conhecido mudanças nas paisagens naturais, ou com mudanças ambientais inferidas a partir de análises dos sedimentos orsoils2. A análise das mudanças da Comunidade em resposta a mudanças ambientais nos proporciona a capacidade de quantificar gabaritos eco-evolutivo42 que têm consequências importantes na população persistência43, interações tróficas44 , comunidade Assembleia45e mudanças no46, de funções e serviços do ecossistema. Finalmente, previsões precisas sobre respostas biológicas às mudanças ambientais são fundamentais para orientar a proteção da biodiversidade47. Modelos de previsão atuais são imprecisos a este respeito, porque eles não levam em conta importantes biológico mecanismos tais como demografia, dispersão, evolução e interações de espécies. Entender como estes processos mudam ao longo do tempo e usar esta informação como um prior em modelagem de previsão irão melhorar a nossa capacidade de prever a espécie e persistência da Comunidade face ambiental mudar2.
A aplicação do SOP apresentado aqui não é sem desafios. A principal limitação de ressuscitar estágios dormentes é a necessidade de equipamento especializado para amostragem. Além disso, todo o processo, de sedimentos peneirando para estabelecimento de culturas clonais, requer um tempo considerável hands-on.
Algumas das etapas SOP aqui apresentadas são facilmente transferíveis para outras espécies Daphnia . Estas são: amostragem, estabelecimento de linhas clonais e delineamento experimental. No entanto, outras etapas do SOP podem requerer novas otimização sob medida para as espécies em estudo. Desencapsulamento é muitas vezes aplicado para d. magna espécimes para melhorar o sucesso da incubação. No entanto, esta abordagem pode não ser adequada para amostras pequenas. Incubação de estímulos também pode variar entre espécies48 e entre espécime coespecíficas49. Assim, uma otimização ad hoc , as etapas de incubação da SOP pode ser necessária antes de aplicativos de outros crustáceos. Enquanto o sucesso da incubação da população d. magna ressuscitada anel Lago (30,5% em todo o arquivo sedimentar) está em consonância com os anteriores resultados49, o sucesso da incubação varia com o estado de preservação dos sedimentos, as espécies 50,,51e a origem geográfica do sedimento48. Estudos futuros sobre os mecanismos que regulam a entrada e progressão através das fases de diapausa é necessário para identificar estímulos ideal para incubação adaptados às diferentes espécies.
Finalmente, fundo conhecimento do sistema de estudo, em particular a presença das espécies de interesse ao longo do tempo, é aconselhável. Isto pode ser conseguido através de registros históricos. Se não existem registros históricos, amostragem e triagem das camadas superficiais do sedimento do lago antes da amostragem de núcleo é aconselhável, embora pode fornecer informações apenas sobre a história mais recente.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela subvenção destaques NERC (NE/N016777/1). Ensis Ltd, centro de investigação de mudança ambiental, serviços ambientais científicos, University College London amostrados e datado o núcleo de sedimentos.
sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
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white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
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statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
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mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick – Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 – Size standard compatible with ABI sequencers |
ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |