מחקרים ארוכי טווח חיוניים להבנת תהליך האבולוציה ולא על מנגנוני הסתגלות. באופן כללי, מחקרים אלה דורשות התחייבויות מעבר חיים החוקרים. . הנה, שיטה חזקה מתואר באופן דרמטי ההתקדמות איסוף נתונים המדינה-of-the-art להפיק נתוני האורך בתוך מערכות טבעיות.
מחקרים ארוכי טווח מאפשרות זיהוי תהליכי eco-אבולוציוניים המתרחשים לאורך פרקי זמן ארוכים. בנוסף, הם מספקים מפתח בנתונים אמפיריים הנתנות ב דוגמנות חזוי לתחזית אבולוציונית תגובות של מערכות אקולוגיות טבעיות לשינויים סביבתיים בעתיד. עם זאת, לא כולל כמה מקרים חריגים, מחקרים ארוכי טווח ואספקות נדירים בגלל קשיים לוגיסטיים הקשורים עם גישה לדוגמיות טמפורלית. דינמיקה טמפורלית נלמדים לעתים קרובות במעבדה או בניסויים מבוקרים mesocosm עם מחקרים יוצאי דופן לשחזר את האבולוציה של אוכלוסיות הטבעי בטבע.
. הנה, סטנדרטי (SOP) מסופק להחיות או להחיות רדום דפניה magna, זן keystone זואופלנקטון נרחבת של המערכת האקולוגית הימית, לקדם באופן דרמטי את אוסף נתוני האורך המדינה-of-the-art מערכות טבעיות. בתחום אקולוגיה תחיית המתים הוגדרה בשנת 1999 על-ידי Kerfoot ועמיתים לעבודה, אף-על-פי הראשון ניסיונות הבקיעה diapausing זואופלנקטון ביצים תאריך חזרה בסוף שנות השמונים. מאז העיתון הזרע של Kerfoot, המתודולוגיה של לאוהדיו זואופלנקטון מינים לעתים קרובות יותר ויותר הוחל, למרות הופץ בין מעבדות רק באמצעות העברה ישירה הידע. כאן, הנוהל המתואר המספק פרוטוקול שלב אחר שלב על העשייה לאוהדיו רדום דפניה מגנה ביצים.
שני מחקרים מרכזיים ניתנים ב אשר תגובת כושר לתחייה דפניה מגנה לאוכלוסיות ההתחממות נמדד, ניצול היכולת ללמוד לאוכלוסייה היסטוריים ומודרניים באותן ההגדרות. לבסוף, נדון היישום של טכנולוגיות רצף ‘ הדור הבא ‘ בשלבים לתחייה או עדיין רדום. טכנולוגיות אלה מספקים כוח חסר תקדים בניתוח של תהליכים ומנגנונים של האבולוציה, אם חלה על אוכלוסיות שעברו שינויים בלחץ הבחירה לאורך זמן.
מחקרים ארוכי טווח הם קריטיים להבנת תהליכים אקולוגי ואבולוציוני בטבע, בהערכת להגיב וכיצד נמשכות במהלך שינוי סביבתי1מינים. זה בגלל תהליכי eco-אבולוציונית לקרות על פני דורות, שינויים בסביבת מתקיימים לאורך זמן טווחי זמנים. יתר על כן, מחקרים ארוכי טווח לספק מפתח בנתונים אמפיריים, לשפר את הדיוק של דוגמנות חזוי לתחזית אבולוציונית תגובות של מערכות אקולוגיות טבעיות שינויים סביבתיים2. הדיוק של מודלים אלה היא קריטית כדי ליישם אסטרטגיות ניהול ושימור לשמירה על המגוון הביולוגי שירותי המערכת האקולוגית.
לא כולל כמה מקרים יוצאי דופן (למשל, גלפאגוס דארווין פרושים3 ואצות4), מחקרים ארוכי טווח מוגבלים בעיקר מינים עם זמן דור קצר, אותם ניתן להפיץ ב מעבדה5,6 , 7 , 8. לפיכך, התהליכים דינמיקה אבולוציונית לגורם המרכזי עליו מושתתת נשארים חמקמקים. בגלל קשיים לוגיסטיים הקשורים עם גישה לדוגמיות הטמפורלי, בנתונים אמפיריים נלמדים בתדירות גבוהה יותר ב מרחבית יותר בהקשר הטמפורלי, תהליכי eco-אבולוציונית טמפורלית להסיק או המודל של נתונים מרחביים. גישה זו מכונה ‘מרחב-עבור-time’ החלפת9, לפיה שטח מאומצת כתחליף בחקר דינמיקה אבולוציונית טמפורלית. המגבלה העיקרית ההחלפה ‘מרחב-עבור-time’ היא כי המחירים של הסתגלות המרחבי בקני מידה שונים נבדלים וריאציה טמפורלית מאותה אוכלוסייה; לפיכך, מסקנות בהתבסס על החלפה של זמן עם שטח הם משוחד10.
חלופה רב עוצמה המאפשר לימוד דינמיקה אבולוציונית של מערכות אקולוגיות טבעיות לאורך זמן הוא הניתוח של שינויים אקולוגיים ולא גנטי במין בהפקת שלבים רדום11. אלה שלבים רדום לארכיון ביולוגי טופס מרובדת שניתן באופן מדויק מיום ולצבור paleolimnologically מאופיין12,13. חשוב, השלבים האלה רדומים יכולים להיות החיינו ומשמשת בניסויים במעבדה, איפה את תגובתם אבולוציונית השינוי הסביבתי ניתן למדוד ישירות. אוכלוסיות ההיסטורי יכול להיות התחרו נגד צאצאיהם מפותחת המודרנית ללמוד כושר שינויים והפונקציה של גנים מתפתח בשלב עם שינוי סביבתי14,15,16.
שלבים רדום כוללים זרעים, ציסטות, נבגים, ביצה בנקים. למרות המחקרים הראשונים על החיו ביצים רדום שתחילתה בסוף שנות השמונים17ו קומץ של מחקרים החלת טכניקה זו בתחילת שנות ה-9018,19, בתחום אקולוגיה התחייה היה באופן רשמי הוקמה על ידי העיתון החלוצי של Kerfoot ועמיתים 199920. פרקטיקה זו הוחל בעיקר בתחום paleolimnological שחזורים של מים מתוקים מינים17,21,22. עם זאת, שוחד אינה זמינה עדיין. כאן, מספק תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול תחיית המתים שהוחל ביצים רדום של המין זואופלנקטון דפניה magna , מן הדוגמאות של שנלכד להקמת תרבויות המשובטים הוולדות. הצעדים של ה-SOP המתעכבים ברצון מינים אחרים של דפניה, כמו גם פעולות שעשויות לדרוש נוספים מיטוב, הם דנו.
דפניה הם מים מתוקים zooplankters נוכח ברוב המכריע של בתי גידול lotic23 . דפניה מינים הם גם parthenogens אל-זוויגית או מחזורי גידול. מאגנה ד הוא parthenogen מחזורית מתרבה clonally תחת תנאים סביבתיים נוחים24. כאשר התנאים הסביבתיים להתדרדר, ייצור זכר מתרחשת ומוביל רקומבינציה מינית את היווצרות של הביצים זה להיכנס למצב של תרדמה מוגן מן הסביבה על-ידי תיק כיטין שנקרא ephippium. שיעור של הביצים רדום בוקעות תנאים סביבתיים נוחים חוזרים. עם זאת, חלק גדול של הבנק הביצה הרדומה מעולם לא יש סיכוי לבקוע, ובכך לבנות את ארכיון ביולוגי לאורך זמן. שלבים רדום שישאר קבור ב המשקע של אגמים, בריכות, יכול להיות לתחייה לחקר דינמיקה אבולוציונית לאורך פרקי זמן ארוכים. כיוון ביצים רדום של magna ד הם התוצאה של רקומבינציה מינית, הן ייצוג טוב של המגוון הגנטי הטבעי של מינים25. יתר על כן, הם יכולים להישמר דרך רבייה המשובטים במעבדה. מאפיינים אלו מספקים את היתרון הייחודי של אורגניזמים דגם isogenic, תוך שמירה על המגוון הגנטי טבעי.
שני מחקרים מפתח מוצגים כדי להדגים את היתרונות של ישירות השוואת היסטוריים ומודרניים צאצאי האוכלוסייה באותו מגנה ד חווה לחץ סביבתי הבחירה לאורך זמן. מאגנה ד דגימות שהוקמו לתחייה מן האגם טבעת (דנמרק), רדוד (עומק 5m; פני 22 ha) בריכה מעורבת שחווה גידול ממוצע טמפרטורה, גלי חום שמתרחשת לאורך זמן. אוכלוסיות מגנה ד (sub) היו לתחייה לאורך זו הדרגה הזמנית המתפרסות על-פני 60 שנה (1960-2005) ולמד לחקור תגובה אבולוציונית טמפרטורה להתחממות. במחקר הראשון בניסוי גן משותף, שינויים בכושר-מקושרים על החיים תכונות נמדדו בתגובה לעלייה בטמפרטורה של C ° +6, בקו אחד עם הנבואה של הפאנל הבין-ממשלתי לשינוי האקלים 100 השנים הקרובות 26. במחקר השני, ניסוי mesocosm שימש כדי למדוד את יכולותיהם תחרותי של שלושת האוכלוסיות (sub) תחת התחממות כדור הארץ. ניסויים אלה בשילוב מראים כי בנוכחות של התחממות כדור הארץ כמו הלחץ היחיד, כל תכונות היסטוריית החיים של אוכלוסיות להציג רמה גבוהה של פלסטיות יכולות תחרותי שווה. ממצאים אלה מראים כי ההתחממות כמו מצוקה מטיל עלויות משמעותי כושר, לפחות בקרב האוכלוסייה למד כאן.
עקב מוליכות חום גבוהה של מים, מערכות אקולוגיות מים מתוקים הם בסיכון גבוה יותר של המגוון הביולוגי אובדן מאשר המערכות האקולוגיות יבשתי מול הכללית התחממות34 חיוני, לכן, כדי להבין את התגובה של keystone מינים של מערכות אקולוגיות אלו ולזהות מנגנוני ההתמודדות לשרוד מתח תרמי. ההבנה של מנגנונים אלה ברמות מינים והקהילה יכול לעזור לחזות כיצד מינים שמושפעים התחממות וגולש איך ההשפעה על מינים בודדים לרמות אחרות הזנה. בסופו של דבר, הבנת מנגנוני תגובות על התחממות כדור הארץ מאפשר הזיהוי של תיקונים אסטרטגיות להפחתת extinctions.
מחקרים המובאים כאן מראים כי תגובת מגנה ד בטמפרטורה pervasively מתווך על ידי פלסטיות של תכונות היסטוריית החיים ולא כי בתגובה בטמפרטורה לבד לכפות עלויות כושר ברורה, לפחות האוכלוסייה למד כאן. פלסטיות גבוהה בתכונות היסטוריית החיים נתמך על ידי הבדלים שאינם משמעותיים ביכולות מתחרות של האוכלוסיות (sub) בנוכחות התחממות כדור הארץ. עם זאת, התחרות וקהילותיהם, ניסויים אוכלוסיות מרובות ייתכן שיהיה צורך להכליל ממצאים אלה.
תחייתו של שלבים רדום מספק משאב חסר תקדים ללמוד מנגנוני הסתגלות ואת מסלולי התפתחות של זן עד שעה10. זואופלנקטון מינים תועלת זמן דור מהירה (כשבועיים), ואת הכדאיות של שלבים רדום, אשר מאפשר קדום. כדי להתחרות headtohead נגד צאצאיו משלו, או ‘החוזר’ האבולוציה שמתחיל ממדינות שונות בעבר. תחיית המתים אקולוגיה בעיקרו של דבר מאפשר החקירה של תוצאה אבולוציונית מיוחדת נמדדת לפי כמה אירועים קודמים. זיהוי מרכיבים גנטיים של אבולוציה אפשרית כיום בניסויים במעבדה בעזרת מיקרואורגניזמים שעבורם ‘שורות אב קדמון’ קפוא, להחיות אותו לניתוח השוואתי עם צאצא מפותחת שלהם6. עם זאת, אחת המגבלות העיקריות של עבודה עם מעבדה אורגניזמים הוא ‘המדינה אב קדמון’ הוא בסיסית שהוסטו כבר. המחקר של שלבים רדום מאפשר הדוגמאות של דגימות מן הזמן לגירושן לכל אירוע דחק (למשל, תנאים סביבתיים וטהור) וכדי למדוד מסלולים אבולוציונית מתנאי הסביבה ללא הפרעה למדינות שונות בעבר עד לתקופה המודרנית. בשנים האחרונות, המחקר של ה-DNA פולימורפיזם בשלבים זואופלנקטון לתחייה או עדיין רדום סיפקה תובנות חשובות האחרונות תהליכים דמוגרפיים, מסתגלת תרמו הגנטי של אוכלוסיות של ימינו14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. עם נגישות גבוהה יותר של טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה, הגנום ואת transcriptome של שלבי לתחייה או עדיין רדום יכול להיות רציף, סוג ומספר שינויים גנטיים שנצבר המתפתחת אוכלוסיות מעל הזמן נמדד.
התקומה SOP המוצג כאן יש ליישומים חשובים בתחום של מולטי-טכנולוגיות על שתי רמות. טכנולוגיות רב ניתן ליישם דגימות לתחייה, המאפשר ניתוח ממצה של היסודות המולקולריים המעורבים בתגובות הסתגלות ללחץ הסביבה הבחירה. בנוסף, טכנולוגיות ניתן ליישם decapsulated אלא שלבי עדיין רדום. עד כה, היישום של טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה לנוח שלבים היה מוגבל על ידי הדרישה של כמות גדולה של חומר קלט. מגבלות אלה מתבצעת והרימה אותה37. עם הדרישות להורדת חומר קלט ולהתקדם בעזרת nanofluidics, רצף הגנום כולו (WGS) אפשרי עכשיו מ קטנה כמו 1 ng או כמה pg להתחיל גשמי38. השימוש של הגנום כולו הגברה (WGA) וטכניקות הגברה (של WTA) כל transcriptome, המאפשרת את העשרת של DNA ו- RNA של כמויות קטנות מאוד של רקמות, יש מהפכה39,metagenomics40 וגם רפואי מחקר41. טכנולוגיות אלה חלה על ביצים רדום decapsulated לאפשר את חריגה של מגבלות הקשורים הכדאיות של שלבים רדום של חוקרים של תקופות זמן ממושך (למשל, מאות שנים).
תחייתו של קהילות הגעה בהפקת שלבים מנוחתו מאפשר היישור של סיפורי הקהילה בשינויים ידועים של הנופים הטבעיים, או עם שינויים סביבתיים להסיק מניתוחי של משקעים orsoils2. הניתוח של הקהילה משתנה בתגובה לשינוי סביבתי מספק לנו את היכולת לכמת פידבקים eco-אבולוציונית42 שיש להם השלכות משמעותית על ההתמדה האוכלוסייה43, אינטראקציות עם מחלות44 , הקהילה הרכבה45, ושינויים במערכת האקולוגית פונקציות ושירותים46. לבסוף, תחזיות מדויקות לגבי תגובות ביולוגיות שינוי סביבתי הם הכרחיים כדי להנחות את ההגנה של המגוון הביולוגי47 מודלים הנוכחית אינם מדויקים בהקשר זה כי הם לא עשה חשבון מנגנונים ביולוגיים חשובים כגון דמוגרפיה, פיזור, האבולוציה מינים אינטראקציות. הבנה כיצד תהליכים אלה משתנים במשך הזמן ושימוש במידע זה כמו לכהן ב דוגמנות תחזית ישפר את היכולת שלנו לחזות מינים ושנה הקהילה התמדה אל מול הסביבה2.
היישום של ה-SOP המובאת כאן אינה ללא אתגרים. המגבלה העיקרית של לאוהדיו שלבים רדום הוא הצורך של ציוד מיוחד עבור הדגימה. בנוסף, התהליך כולו, מן המשקעים ניפוי להקמה של תרבויות המשובטים, דורש זמן ניכר על הידיים.
חלק מהשלבים SOP המובאת כאן המתעכבים ברצון מינים דפניה אחרים. אלה הם: דגימה, הקמת קווי המשובטים, תכנון ניסויים. עם זאת, צעדים אחרים של ה-SOP עשויים לדרוש עוד יותר אופטימיזציה המותאמים למין שנבחנה. Decapsulation לעיתים קרובות חלה על דגימות מגנה ד כדי לשפר את ההצלחה הבקיעה. עם זאת, גישה זו עשוי לא להיות מתאים דגימות קטנות יותר. הבקיעה גירויים יכול להשתנות גם בין המינים48 ובין הדגימה conspecific49. לפיכך, לאופטימיזציה אד הוק של המדרגות הבקיעה של ה-SOP עשוי להידרש לפני ליישומים אחרים. בזמן הבקיעה ההצלחה של האוכלוסייה מגנה ד לתחייה מן האגם טבעת (30.5% על פני הארכיון משקע) עולה בקנה אחד עם תוצאות קודמות49, הבקיעה הצלחה משתנה עם מצב ההשתמרות המשקע, המין 50,51, המקור הגיאוגרפי של משקעים48. מחקרים עתידיים על המנגנונים המווסתים כניסה וההתקדמות דרך השלבים של תרדמה ואסטרטגיה נדרש לזהות גירויים הבקיעה האופטימלי לצרכיו מינים שונים.
לבסוף, רקע הידע של מערכת המחקר, בפרט, נוכחותם של המינים של הריבית לאורך זמן, מומלץ. זו יכולה להיות מושגת באמצעות רשומות היסטוריות. אם רשומות היסטוריות אינן זמינות, דגימה, הקרנת משטח שכבות המשקע אגם לפני דגימה הליבה, מומלץ, למרות שזה מספק מידע רק על ההיסטוריה האחרונה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המענק מדגיש NERC (NE N016777 1). Ensis בע מ, שירותי מדעי הסביבה, המרכז לחקר שינוי סביבתי, אוניברסיטת קולג ‘-לונדון שנדגמו, יצאתי עם ליבת משקעים.
sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve – 1 mm mesh |
geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve – 0.125 mm mesh |
white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw – 0.9mL |
stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick – Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 – Size standard compatible with ABI sequencers |
ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |