Lange termijn studies zijn essentieel voor het begrip van het proces van evolutie en de mechanismen van aanpassing. In het algemeen, vereisen deze studies verplichtingen buiten de levensduur van onderzoekers. Hier is een krachtige methode beschreven die dramatisch state-of-the-art gegevensverzameling voorschotten voor het genereren van de longitudinale gegevens in natuurlijke systemen.
Langetermijnstudies inschakelen de identificatie van eco-evolutionaire processen die over langere tijd plaatsvinden. Daarnaast bieden ze belangrijke empirische gegevens die kunnen worden gebruikt in de predictieve modellering te voorspellen van evolutionaire reacties van natuurlijke ecosystemen op toekomstige veranderingen in het milieu. Met uitzondering van een paar uitzonderlijke gevallen zijn op lange termijn studies echter schaars vanwege logistieke problemen met de toegang tot tijdelijke monsters. Temporal dynamics worden vaak bestudeerd in het laboratorium of in gecontroleerde mesokosmosstudie experimenten met uitzonderlijke studies die de evolutie van natuurlijke populaties in het wild te reconstrueren.
Hier, wordt een standaard gebruiksprocedure (SOP) verstrekt aan doen herleven of herrijzen slapende Daphnia magna, een wijdverbreide zoöplankton keystone soorten in aquatische ecosystemen, om dramatisch de collectie van de state-of-the-art longitudinale gegevens in natuurlijke systemen. Het gebied van de ecologie van de opstanding werd in 1999 gedefinieerd door Kerfoot en collega’s, hoewel de eerste pogingen tot broedeieren diapausing zoöplankton eieren dateren uit de late jaren 1980. Sinds de Kerfoot rudimentaire papier, is de methodologie van het zoöplankton soorten resurrecting steeds vaker toegepast, hoewel doorgegeven tussen laboratoria alleen via directe kennisoverdracht. Hier, een SOP wordt beschreven waarmee een stapsgewijze protocol op de praktijk van slapende Daphnia magna resurrecting eieren.
Twee belangrijke studies worden verstrekt die de fitness reactie van Daphnia magna populaties te doen herleven opwarming van de aarde is gemeten, inspelend op de mogelijkheid te bestuderen van historische en moderne populaties in dezelfde instellingen. Ten slotte, de toepassing van de technologieën van de volgende generatie sequencing naar nieuw leven ingeblazen of nog slapende fases wordt besproken. Deze technologieën bieden ongekende macht in de ontrafeling van de processen en mechanismen van de evolutie als toegepast op bevolkingsgroepen die hebben ervaren veranderingen in selectiedruk na verloop van tijd.
Lange termijn studies zijn cruciaal voor het begrip van de ecologische en evolutionaire processen in de natuur en bij de beoordeling van hoe soorten inspelen en aanhouden gedurende milieuveranderingen1. Dit komt doordat eco-evolutionaire processen verschillende generaties gebeuren en veranderingen in het milieu over lange tijd omspant optreden. Bovendien zorgen de langetermijnstudies empirische sleutelgegevens die de nauwkeurigheid van predictieve modellering verbeteren te voorspellen van evolutionaire reacties van natuurlijke ecosystemen op veranderingen in het milieu2. De nauwkeurigheid van deze modellen is cruciaal voor de uitvoering van beheer en de instandhouding strategieën voor het behoud van biodiversiteit en ecosysteemdiensten.
Met uitzondering van een paar uitzonderlijke gevallen (bijvoorbeeld, Galapagos Darwin vinken3 en algen4) zijn op de lange termijn studies grotendeels beperkt tot de soorten met korte generatietijd die kan worden gekweekt in het laboratorium5,6 , 7 , 8. Vandaar, de versterking van de dynamiek van de evolutionaire processen blijven ongrijpbaar. Vanwege logistieke problemen met de toegang tot tijdelijke monsters, empirische gegevens vaker worden bestudeerd in een ruimtelijke dan in een temporele context en temporele eco-evolutionaire processen zijn afgeleid of gemodelleerd van ruimtelijke gegevens. Deze benadering staat bekend als ‘ruimte-voor-tijd’ vervanging9, waarbij ruimte is aangenomen als een surrogaat te bestuderen van de temporele evolutionaire dynamiek. De belangrijkste beperking van de vervanging van ‘ruimte-voor-tijd’ is dat de tarieven van aanpassing op verschillende ruimtelijke schalen van temporele variatie in dezelfde populatie verschillen; Vandaar, zijn gevolgtrekkingen gebaseerd op vervanging van tijd met ruimte vooringenomen10.
Een krachtig alternatief waarmee het bestuderen van evolutionaire dynamiek in natuurlijke ecosystemen na verloop van tijd is de analyse van ecologische en genetische veranderingen in soort slapende fases11produceren. Deze slapende fases accumuleren tot formulier gelaagde biologische archieven die nauwkeurig gedateerd kunnen worden en paleolimnologically12,13gekenmerkt. Nog belangrijker is, kunnen deze slapende fases worden gereanimeerd en gebruikt in laboratoriumexperimenten, waar hun evolutionaire reactie op veranderingen in het milieu kan rechtstreeks gemeten worden. Historische populaties kunnen worden concurreerden tegen moderne geëvolueerd nazaten fitness wijzigingen en de functie van genen in stap met milieuveranderingen14,15,16in ontwikkeling te gaan studeren.
Slapende fases zijn zaden, cysten, sporen en ei banken. Hoewel de eerste studies over slapende eieren gereanimeerd dateert uit de late jaren 198017, en een handvol studies deze techniek in de vroege jaren 199018,19toegepast hebben, is het gebied van opstanding ecologie formeel geweest opgericht door het baanbrekende document uit Kerfoot en collega’s in 199920. Deze praktijk heeft toegepast voornamelijk in paleolimnological reconstructies van zoetwater soorten17,21,22. Een SOP is echter nog niet beschikbaar. Hier, wordt een stapsgewijze beschrijving van het protocol van de opstanding toegepast op slapende eieren zoöplankton soorten Daphnia magna geleverd, door de bemonstering van sediment aan de oprichting van klonen culturen van hatchlings. Stappen van de SOP die zijn gemakkelijk overdraagbaar naar andere soorten Daphnia, evenals stappen waarvoor aanvullende optimalisatie, kunnen worden besproken.
Daphnia worden zoetwater zooplankters aanwezig in de meeste lotic habitats23 . Daphnia -soorten zijn ofwel obligate ongeslachtelijke of cyclische parthenogens. D. magna is een cyclische parthenogen die klonaal onder gunstige omgevingsfactoren24 reproduceert. Als milieu-omstandigheden verslechteren, mannelijke productie vindt en seksuele recombinatie leidt tot de vorming van bevruchte eieren die worden ingevoerd door een staat van ruststadia beschermd tegen het milieu een zaak van de chitine ephippium genoemd. Een deel van deze slapende eieren uitkomen wanneer gunstige omgevingsfactoren terugkeert. Een groot deel van de slapende ei-bank heeft echter nooit een kans om uitkomen en dus biologische archieven na verloop van tijd opbouwen. Slapende fases blijven begraven in de sedimenten van meren en vijvers en over langere tijd voor de studie van evolutionaire dynamiek kunnen worden opgewekt. Omdat slapende eieren van D. magna het resultaat van seksuele recombinatie zijn, zijn ze een goede vertegenwoordiging van de natuurlijke genetische diversiteit van de soorten25. Bovendien kunnen ze via klonen reproductie in het laboratorium worden gehandhaafd. Deze kenmerken geven het unieke voordeel van isogene modelorganismen, met behoud van de natuurlijke genetische diversiteit.
Twee belangrijke studies worden voorgesteld om aan te tonen van de voordelen van direct vergelijken historische en moderne afstammelingen van dezelfde populatie van D. magna milieu selectiedruk ervaren na verloop van tijd. D. magna exemplaren werden herrezen uit Lake Ring (Denemarken), een ondiep (5 m diepte, oppervlakte 22 ha) gemengde vijver die heeft ervaren een toename in gemiddelde temperatuur en hittegolven ontstaan na verloop van tijd. D. magna (sub) populaties werden opgewekt langs deze tijdelijke gradiënt 60 jaar (1960 – 2005) en studeerde voor het onderzoek naar de evolutionaire reactie op temperatuur opwarming van de aarde. In de eerste studie in een gemeenschappelijke tuin experiment, werden veranderingen in de fitness-linked levensgeschiedenis eigenschappen gemeten in reactie op een stijging van de temperatuur van + 6 ° C, in overeenstemming met de voorspellingen van het Intergouvernementele Panel voor klimaatverandering voor de komende 100 jaar 26. in de tweede studie, een mesokosmosstudie experiment werd gebruikt voor het meten van de concurrerende capaciteiten van de drie (sub) bevolking onder de opwarming van de aarde. Deze combinatie experimenten tonen aan dat alle levensgeschiedenis eigenschappen en populaties in aanwezigheid van de opwarming van de aarde als de enige stress, Toon van een hoog niveau van plasticiteit en gelijke concurrerende capaciteiten hebben. Deze bevindingen stellen voor dat opwarming van de aarde als een interne stress geen significante fitness kosten, ten minste in de bevolking legt hier bestudeerd.
Als gevolg van de hoge thermische geleidbaarheid van het water, zoetwater ecosystemen zijn op hoger risico van verlies aan biodiversiteit dan terrestrische ecosystemen in het gezicht van wereldwijde opwarming van de aarde34. Het is daarom essentieel zijn voor het begrijpen van de reactie van keystone soorten in deze ecosystemen en identificeren van coping-mechanismen om te overleven van thermische stress. Het begrip van deze mechanismen op soorten en communautair niveau kunt voorspellen hoe soorten zijn beïnvloed door de wereldwijde opwarming van de aarde en hoe het effect op de afzonderlijke soorten cascades stroomt aan andere trofische niveaus. Uiteindelijk maakt begrijpen van mechanismen voor reacties op mondiale opwarming van de aarde de identificatie van saneringsstrategieën te verzachten extincties.
De casestudy’s die hier gepresenteerd blijkt dat de reactie van D. magna op temperatuurstijging pervasively is bemiddeld door plasticiteit in levensgeschiedenis trekken en dat antwoord op de temperatuurverhoging van de alleen geen duidelijk fitness kosten legt, althans in de bevolking studeerde hier. Hoge plasticiteit in levensgeschiedenis eigenschappen wordt ondersteund door niet-significante verschillen in concurrerende capaciteiten van de bevolking van de (sub) in het bijzijn van de opwarming van de aarde. Langerlopende competitie experimenten op meerdere populaties kunnen echter nodig zijn om te generaliseren van deze bevindingen.
Opstanding van slapende fasen biedt een ongekende resource om te studeren Adaptatiemechanismen en trajecten voor een soort evolution t/m10van de tijd. Zoöplankton soorten profiteren van een snelle generatietijd (ongeveer 2 weken), en de levensvatbaarheid van slapende fases, waarmee een voorouder te concurreren headtohead tegen eigen nakomelingen, of om ‘replay’ evolutie die vanaf verschillende afgelopen Staten begint. Opstanding ecologie in wezen in staat stelt het onderzoek of een bepaalde evolutionaire uitkomst is afhankelijk van een voorafgaande gebeurtenis. De identificatie van de genetische elementen van evolutie is momenteel mogelijk in laboratoriumexperimenten met behulp van micro-organismen waarvoor ‘voorouderlijke lijnen’ zijn bevroren en gereanimeerd voor vergelijkende analyse met hun geëvolueerd afstammeling6. Een van de belangrijkste beperkingen van het werken met laboratorium organismen is echter dat de “voorouderlijke staat” een reeds verschoven basislijn is. De studie van slapende stadia kunt de bemonstering van specimens van tijd vóór elk evenement van de stress (bijv., ongerepte milieuomstandigheden) en voor het meten van de evolutionaire trajecten van milieu onverstoorde naar verschillende afgelopen Staten tot de moderne tijd. In de afgelopen jaren heeft de studie van DNA polymorfisme in opgestane of nog slapende zoöplankton fasen belangrijk inzicht in afgelopen demografische en adaptieve processen die hebben bijgedragen aan de genetische samenstelling van de huidige populaties14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. met de hogere toegankelijkheid van hoge-doorvoer sequencing technologieën, het genoom en de transcriptome opgestane of nog slapende fasen kunnen worden sequenced en het type en aantal genetische veranderingen in het evoluerende populaties opgebouwde tijd gemeten.
De opstanding SOP hier gepresenteerd heeft belangrijke toepassingen op het gebied van multi-omics op twee niveaus. Multi-omics-technologieën kunnen worden toegepast op de opgestane specimens, waardoor een uitputtende analyse van de moleculaire elementen die betrokken zijn bij adaptieve reacties op milieu selectiedruk. Daarnaast kunnen omics-technologieën worden toegepast op gepelde maar nog slapende fases. Tot dusver heeft de toepassing van hoge-doorvoer sequencing technologieën tot rust stadia beperkt gebleven door de eis van een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal. Deze beperkingen worden opgeheven37. Met de verlaging eisen voor uitgangsmateriaal en vooruitgang in nanofluidics, hele genoom sequencing (WGS) is nu mogelijk uit zo weinig als 1 ng of een paar pg materiële38te starten. Het gebruik van hele genoom versterking (WGA) en hele transcriptome versterking (WTA) technieken, waardoor de verrijking van DNA en RNA van zeer kleine hoeveelheden weefsel, heeft een revolutie teweeggebracht in zowel de medische als de metagenomics39,40 onderzoek41. Deze technologieën toegepast op gepelde slapende eieren kunnen de overschrijding van de beperkingen die zijn gekoppeld aan de levensvatbaarheid van slapende fases en de onderzoeken van de langere termijnen (bijvoorbeeld, eeuwen).
De opstanding van ongewervelde gemeenschappen produceren rust stadia kunt de uitlijning van communautaire geschiedenissen met bekende veranderingen in de natuurlijke landschappen, of veranderingen in het milieu afgeleid uit analyses van de sedimenten orsoils2. De analyse van de Gemeenschap veranderingen in reactie op veranderingen in het milieu biedt ons de mogelijkheid om te kwantificeren van eco-evolutionaire feedback42 die aanzienlijke gevolgen hebben voor de bevolking persistentie43, trofische interacties44 , communautaire vergadering45, en veranderingen in het ecosysteem functies en diensten46. Ten slotte, accurate voorspellingen over biologische reacties op veranderingen in het milieu staan bij de bescherming van biodiversiteit47. Huidige voorspellende modellen zijn onjuist in dit opzicht, omdat ze niet rekening account belangrijke biologische mechanismen zoals demografie, verspreiding, evolutie en soorten interacties. Begrijpen hoe deze processen veranderen na verloop van tijd en met behulp van deze informatie als een prior in verwachte modellering zal verbeteren ons vermogen om te voorspellen van soorten en Gemeenschap persistentie in het gezicht van milieu wijzigen2.
De toepassing van het hier gepresenteerde SOP is niet zonder problemen. De belangrijkste beperking van resurrecting slapende fases is de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur voor de bemonstering. Bovendien, vereist het hele proces, van sediment zeven tot oprichting van de culturen van het klonen, aanzienlijke hands-on tijd.
Enkele van de stappen van de SOP hier gepresenteerd zijn gemakkelijk overdraagbaar naar andere Daphnia -soorten. Dit zijn: bemonstering, oprichting van klonen lijnen en experimenteel design. Andere stappen van het SOP kunnen echter verdere optimalisatie afgestemd op de soort bestudeerde. Uitpakken van gegevenspakketten verstaan wordt vaak toegepast voor D. magna specimens to improve succes van broedeieren. Echter, deze aanpak mogelijk niet geschikt voor kleinere exemplaren. Broedeieren van prikkels kan ook verschillen tussen soorten48 en conspecific specimen49. Vandaar, een ad hoc- optimalisatie van de broedeieren stappen van de SOP kan worden vereist vóór toepassingen voor andere schaaldieren. Hoewel het succes van de broedeieren van de bevolking van de D. magna herrezen uit Lake Ring (30,5% over de sedimentaire archief) in overeenstemming met de eerdere resultaten49, varieert broedeieren succes met de staat van instandhouding van het sediment, de soorten 50,51, en de geografische oorsprong van het sediment48. Toekomstige studies over de mechanismen die ingang en progressie door de fasen van de diapauze regelen is vereist voor het identificeren van de optimale broedeieren prikkels op maat van verschillende soorten.
Tenslotte, de achtergrond van kennis van de studie-systeem, met name de aanwezigheid van de soorten van belang na verloop van tijd is aan te raden. Dit kan worden bereikt via de historische records. Als historische gegevens niet beschikbaar zijn, is bemonstering en screening van de oppervlakte lagen van het sediment lake vóór de bemonstering van de kern het raadzaam, hoewel zij informatie alleen over de meest recente geschiedenis verschaffen kan.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de NERC hoogtepunten subsidie (NE/N016777/1). Ensis Ltd, wetenschappelijke milieudiensten, Environmental Change Research Centre, University College London bemonsterd en gedateerd van de kern van het sediment.
sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve – 1 mm mesh |
geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve – 0.125 mm mesh |
white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw – 0.9mL |
stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick – Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 – Size standard compatible with ABI sequencers |
ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |