Tümör microenvironment eğitim klinik yanıt immünoterapi prognostik veya akýllý biyolojik tespit edebilir. Burada sunulan, bir yöntem situ Floresans spektral analiz ve CD8 otomatik olarak çeşitli altgrupları saymak için görüntüleme üzerinde dayanır+ T hücreleri. Bu tekrarlanabilir ve güvenilir teknik büyük kohort analizi için uygundur.
Bağışıklık hücreleri tümör microenvironment önemli bileşenleridir ve karsinojenezis tüm aşamalarında tümör büyüme ve evrimi etkiler. Özellikle, bu şimdi de insan tümörler bağışıklık infiltrat prognoz ve tedaviye yanıt ile ilişkilendirmek kuruldu. Tümör microenvironment bağışıklık infiltrat analizini hastalar ve tedaviye yanıt sınıflandırılması için büyük bir sorun haline gelmiştir.
İnhibitör reseptörler Program hücre ölüm Protein 1 (PD1; olarak da bilinen CD279), sitotoksik T lenfosit ilişkili Protein 4 (CTLA-4), T-hücre immünglobulin ve müsin içeren Protein-3 (Tim-3; olarak da bilinen CD366) ve lenfosit gibi ortak ifade Harekete geçirmek gen 3 (Lag-3; CD223 olarak da bilinir), T hücre tükenme damgasını olduğunu. Tanımlamak ve hücresel düzeyde Bu inhibitör reseptörler ortak ifade ölçmek için boyama multiparametric in situ ayirt geliştirdik. Renal hücreli karsinom (RCC) dondurulmuş dokusunun retrospektif bir dizi üzerinde bir floresan spektral görüntüleme teknolojisi kullanarak bir görüntü analiz yazılımı ile birleştiğinde, CD8 infiltre tümörle PD-1 ve Tim-3 Co o ifade bulundu+ T hücreleri RCC içinde kötü prognoz ile ilişkilidir. Bu çok katmanlı içinde in situ teknoloji otomatik gösteren ilk çalışma bazı klinik önemi olabilir bizim bilgi için bu temsil eder.
Son birkaç yıl içinde immünoterapi kanserlerinin RCC dahil olmak üzere, birçok türleri için çok umut verici bir tedavi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, inhibitör denetim noktaları inhibisyonu dayalı immünoterapi gibi PD-1 ve klinik olarak etkili1,2,3,4,5, olmak CTLA-4 bildirilmiştir 6. monoklonal antikorlar karşı CTLA-4, PD-1 veya Program ölüm Ligand 1 (PD-L1) zaten çeşitli kanserler içinde onaylanır ve hastalar%720’den fazla uzun süreli klinik yanıt yol açar. Sonuçta, tüm hastalar cevaplama, tedavi maliyeti yüksektir, ve bu tedaviler potansiyel ciddi otoimmün gibi yan etkileri için önde gelen zehirli. Bu nedenle, geçerli meydan bu yeni immunotherapies için akıllı işaretleri belirlemektir. Tümör, PD-L1 ifade veya intratumoral CD8+ T hücre infiltrasyonu ve düzeyde mutasyonların oranı ile klinik yanıt ilişkilendirmek için bildirilmiştir. Ancak, bu ilişki hala bu klinik biyolojik PD-L1 arkadaşı sınava daha önce küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hastaların8 Pembrolizumab yönetiminde dışında klinik pratikte kullanılmasını tavsiye için çok zayıftır ,9,1011,12. PD-1, Tim-3, Lag-3 gibi birçok inhibitör reseptörlerinin ortak ifade ve CTLA-4, indükler bir hücre tükenme fenotip ve terapi13,14,15direnç kanıtlanmıştır. Periferik kan tümör microenvironment temsilcisi olmadığına göre bu hücreleri içinde in situfenotipik özellikleri analiz etmek için yüksek ilgi var. PD-1 ve Tim-3 ortak ifade T hücreleri çeşitli bağlamlarda13,16,17işlevsel olarak Engelli hücrelerde olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, iki inhibitör reseptörler PD-1 ortak ifade ve Tim-3 CD8 prognostik etkisini+ T hücreleri değerlendirildi.
Akış Sitometresi Analizi, taze tümörler ve bu nedenle engelleyen retrospektif analizleri üzerinde çalışmak gerekli olduğunun tarafından ortak ifade birden çok işaretçilerinin tümör infiltre lenfositler (TILs) üzerinde çalışmaya kadar şimdiye kadar esas olarak yapıldı. Geleneksel in situ boyama, tek teker teker boyama gerçekleştirilebilir ve işbirliği işaretleyiciler ifade hücre tipi karakterizasyonu mümkün değildir. Örneğin, PD-L1 PD-L1 ifade hangi hücrelerin Bağdaşık çalışmalar için daha uygun olan geleneksel immünhistokimya analizi tarafından tanımlamak üzere birçok hücre türleri tumoral microenvironment tarafından ifade edilir. Bu çalışmada, geliştirdiğimiz bir yenilikçi in situ multiparametric ayirt yöntemi bilgisayar-PD-1 ve Tim-3 ortak ifade CD8 infiltre tümör tarafından ilişkilendirmek için sayma ile+ T-hücreleri RCC klinik sonuçlar ile. Bu teknik bir tek hücre düzeyi ve birden çok işaretçileri sınırlı aralıklarla yakalayabilir bir spektral kamera ile aynı anda analiz imkanı da dahil olmak üzere çeşitli yararları vardır > 10 nm sıvı kristal ile filtreler18. Ayrıca, bu işlem bir arası operatör tekrarlanabilirlik ve el teknikleri19‘ a göre kısaltılmış bir analiz sağlayan otomatik demek. Kanser alanında çeşitli çalışmalarda Merkel hücreli karsinom, akciğer kanseri ve baş ve boyun kanseri20,21,22, gibi PD-1, PD-L1 ve CD8 bağışıklık moleküllerin birden çok stainings inandırıcı bildirdi 23. otomatik hücre sayısı (fenotipleme adım) kullanıcı tarafından eğitim ile mümkündür. Floresans farklı hücre bölmeleri (nükleuslar, sitoplazma ve membran) ölçülür.
Burada, tümör infiltre-CD8, farklı alt kümelerini+ T hücreleri ifade PD-1 ve/veya Tim-3 RCC büyük bir kohort sayılır ve sonuçları klinik ağırlık puanları ve hayatta kalma parametreleri ile ilişkili. Membran floresan yoğunluğu gibi demek floresan yoğunluğu (MFI) verilerde sitometresi ile hücresel çözünürlükte analiz etmek mümkündü. Bildiğimiz gibi bu bu spektral görüntüleme tabanlı count tekniğin ilk çalışma raporlama prognostik sonuçları kullanarak temsil eder.
Değişiklikler ve sorun giderme:
Doku kalitesi önemli bir parametre. kolayca Hematoksilen ve Eozin renklendirme tarafından denetlenebilir.
Çoğaltılmış stainings imkanı teknik bir avantajı vardır, ancak fluorophore yayılma önlemek için emisyon boyları 10 nm asgari delta ile seçmek için öneririz. Çünkü biz 4 stainings DAPI dahil olmak üzere, burada, dalga boylarında yayılan seçtiniz (DAPI: 460 nm, AF488: 519 nm, siyanür 3:570…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser hibe Institut National du kanser (Inca) (ET), Ligue contre le kanser (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex IMMUNO-Onkoloji (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET) tarafından desteklenmiştir. EdG Fondation ARC Kardeşliği tarafından finanse edildi. EV ve CD APHP (bourse année recherche) Kardeşliği tarafından finanse edilmiştir. Will Université Sorbonne Paris Cité (Kervansaray’a doktora) Kardeşliği tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar Bristol Myers Squibb kendi bu projede finansman için teşekkür ederiz. Yazarlar bölümü patoloji nörölojisi Européen Georges Pompidou ve Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel ve Gisèle Legall) teşekkür ederim. Yazar PARCC, nörölojisi Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre) Histoloji platformunun teşekkür ederiz.
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
R software | https://www.r-project.org | ||
Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |