Estudio de microambiente tumoral puede identificar biomarcadores pronósticos o predictivos de la respuesta clínica a la inmunoterapia. Presentado aquí, es un método innovador basado en situ de la fluorescencia multiespectral de imágenes para analizar y contar automáticamente varias subpoblaciones de CD8+ T las células. Esta técnica reproducible y confiable es adecuada para análisis de grandes cohortes.
Las células inmunes son importantes componentes del microambiente tumoral e influyen en el crecimiento del tumor y la evolución en todas las etapas de la carcinogénesis. En particular, está ahora bien establecido que el infiltrado inmune en tumores humanos puede correlacionan con el pronóstico y respuesta al tratamiento. El análisis de la infiltración inmunitaria en el microambiente del tumor se ha convertido en un reto importante para la clasificación de los pacientes y la respuesta al tratamiento.
La coexpresión de los receptores inhibitorios como programa celular muerte proteína 1 (PD1; también conocido como CD279), citotóxico linfocitos T asociados proteína 4 (CTLA-4), T-Cell de la inmunoglobulina y mucina que contienen proteína-3 (Tim 3; también conocido como CD366) y linfocitos Activación gen 3 (Lag-3; también conocido como CD223), es un sello de agotamiento de la célula de T. Hemos desarrollado una inmunofluorescencia multiparamétrico en situ tinción para identificar y cuantificar a nivel celular la coexpresión de estos receptores inhibitorios. En una serie retrospectiva de tejido congelado de los carcinomas de células renales (RCC), utilizando una tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia junto con un software de análisis de imagen, se encontró que la expresión de PD-1 y Tim-3 el tumor infiltrante CD8+ T células se correlaciona con un pronóstico pobre en RCC. A nuestro conocimiento, esto representa el primer estudio que demuestra que este automatizado tecnología multiplex in situ puede tener alguna importancia clínica.
En los últimos años, la inmunoterapia ha surgido como un tratamiento prometedor para muchos tipos de cánceres, incluyendo RCC. Particularmente, la inmunoterapia basada en la inhibición de los puestos de control inhibitorios como PD-1 y CTLA-4 se ha divulgado para ser clínicamente eficaz1,2,3,4,5, 6. anticuerpos monoclonales contra CTLA-4, PD-1, o programa muerte ligando 1 (PD-L1) están ya aprobados en varios cánceres y conducen a respuestas clínicas duraderas en más del 20% de los pacientes7. Sin embargo, no todos los pacientes son respondedores, el costo del tratamiento es alta, y estos tratamientos son tóxicos, llevando a graves autoinmunes-como efectos secundarios. Por lo tanto, el reto actual es identificar marcadores predictivos para esas nuevas inmunoterapias. La tasa de mutaciones en el tumor, la expresión de PD-L1 o los niveles de intratumoral CD8+ infiltración de células T se han divulgado para correlacionar con la respuesta clínica. Sin embargo, esta asociación sigue siendo demasiado débil para recomendar el uso de estos biomarcadores clínicos en la práctica clínica, salvo la prueba compañero para PD-L1 antes de la administración de Pembrolizumab en células no pequeñas lung cancer (NSCLC) pacientes8 ,9,1011,12. Se ha demostrado que la expresión conjunta de muchos receptores inhibitorios como PD-1 Tim 3, Lag-3, y CTLA-4, induce un fenotipo de agotamiento de la célula y la resistencia a la terapia13,14,15. Desde sangre periférica no es representativa del microambiente tumoral, es de gran interés para analizar las características fenotípicas de las células in situ. PD-1 y Tim-3 Co expresando las células de T son conocidas por ser células funcionalmente deterioradas en varios contextos13,16,17. En este estudio, el impacto pronóstico de la coexpresión de los receptores inhibitorios dos PD-1 y Tim-3 en CD8+ T las células fue evaluada.
Hasta ahora, estudiando la coexpresión de marcadores múltiples de tumor (TILs) los linfocitos de la infiltración se ha realizado principalmente por análisis de citometría de flujo, lo que es necesario trabajar en tumores frescos y por lo tanto perjuicio análisis retrospectivos. Convencionales en situ tinción, tinción sólo uno a la vez puede llevar a cabo, y la caracterización del tipo de la célula que expresa conjuntamente los marcadores no es posible. Por ejemplo, PD-L1 es expresada por muchos tipos de células del microambiente tumoral, lo que es difícil de definir por análisis inmunohistoquímica convencionales que las células que expresan PD-L1 son los más relevantes estudios correlativos. En este trabajo, hemos desarrollado un método innovador en situ multiparamétrico inmunofluorescencia con la cuenta de equipo correlacionar la co-expresión de PD-1 y Tim-3 por tumor infiltrante CD8+ las células T con los resultados clínicos en RCC. Esta técnica tiene varias ventajas, incluyendo la posibilidad de analizar a un nivel unicelular y marcadores múltiples al mismo tiempo usando una cámara multiespectral que puede captar intervalos restringidos > 10 nanómetro a través del cristal líquido filtros18. Por otra parte, el procedimiento es automático que permite un análisis acortado comparado con técnicas manuales19y una reproducibilidad inter-operador. En el campo del cáncer, varios estudios informaron convencer los stainings múltiples de moléculas inmunes como PD-1, PD-L1 y CD8 en carcinoma de células de Merkel, cáncer de pulmón y cabeza y cuello cáncer20,21,22, 23. el recuento celular automatizado es posible con capacitación por parte del usuario (paso de fenotipo). La fluorescencia se mide en los compartimientos diferentes de la célula (núcleo, citoplasma y membrana).
Aquí, diversos subconjuntos de la tumor-infiltración CD8+ T células expresando PD-1 y Tim-3 en una cohorte grande de RCC fueron contados y los resultados fueron correlacionados con las puntuaciones de gravedad clínica y parámetros de supervivencia. También es posible analizar la intensidad de fluorescencia de membrana en la resolución de celular con datos de la intensidad media de fluorescencia (IMF) como en la citometría. Lo que sabemos, esto representa el primer estudio informes pronóstico resultados utilizando esta técnica de conteo basado en proyección de imagen multiespectral.
Modificaciones y resolución de problemas:
La calidad del tejido es un parámetro importante; puede comprobarse fácilmente por la coloración de hematoxilina y eosina.
Una de las ventajas de la técnica es la posibilidad de multiplexado stainings, pero para evitar el contagio del fluoróforo, recomienda para seleccionar longitudes de onda de emisión con delta de 10 mínimo de nm. Aquí, porque teníamos 4 stainings incluyendo DAPI, decidimos difun…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por becas del Instituto Nacional del cáncer (INCA) (ET), Ligue contre le cáncer (ET), Cité Université de Paris Sorbonne (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), empresa Labex inmuno-Oncología (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET). EdG fue financiado por una beca de la Fundación arco. EV y CD fueron financiados por una beca de php (bolsa année recherche). ChB es financiado por una beca de la Université Sorbonne París Cité (contrat doctoral). Los autores agradecen a Bristol Myers Squibb para su financiación en este proyecto. Los autores agradecen al Departamento de patología del hospital Européen Georges Pompidou y Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel y Gisèle Legall). Los autores agradecen la plataforma histología de PARCC, hospital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
R software | https://www.r-project.org | ||
Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |