Изучая микроокружения опухоли может идентифицировать прогностическое или интеллектуального биомаркеров клинической реакции на иммунотерапию. Представленные здесь, инновационный метод основан на в situ флуоресценции многоспектральных изображений для анализа и рассчитывать автоматически различных субпопуляций CD8+ T клетки. Этот воспроизводимый и надежный метод подходит для анализа больших когорты.
Иммунные клетки являются важными компонентами микроокружения опухоли и влияние роста опухоли и эволюция на всех стадиях канцерогенеза. В частности теперь хорошо известно, что иммунной проникнуть в человека опухоли можно соотнести с prognosis и ответа на терапию. Анализ иммунной проникнуть в микроокружения опухоли стал серьезной проблемой для классификации пациентов и ответ на лечение.
Совместное выражение рецепторов ингибирующих такие программы клеток смерть белок 1 (PD1; также известен как CD279), цитотоксических Т-лимфоцитов связанные белка (CTLA-4 4), Т-клеток иммуноглобулина и муцина содержащих протеин-3 (Тим-3; также известен как CD366) и лимфоцитов Активации генов 3 (ЛАГ-3; также известен как CD223), является отличительной чертой истощения Т-клеток. Мы разработали многопараметрических в situ иммунофлюоресценции, пятнать для идентификации и количественной оценки на клеточном уровне совместного выражение этих рецепторов ингибирующих. На ретроспективной серии замороженные ткани почечно-клеточной карциномы (РСС), с использованием многоспектральных изображений технологии флуоресценции в сочетании с анализа изображений программное обеспечение, что Сопредседатель выражение PD-1 и Тим-3 было установлено на опухоли, проникнув CD8+ T клетки связан с плохой прогноз в РКЦ. Насколько нам известно, это представляет собой первое исследование демонстрирует, что это Автоматизированная технология мультиплексный в situ могут иметь некоторые клиническое значение.
В последние несколько лет иммунотерапия стала весьма перспективным лечения для многих видов рака, включая РСС. В частности иммунотерапия, основанные на ингибирование ингибирующее контрольно-пропускных пунктов, как PD-1 и CTLA-4 было сообщено быть клинически эффективным1,2,3,4,5, 6. моноклональных антител против CTLA-4, PD-1, или программа смерти лигандом 1 (PD-L1) уже утвержденных в несколько рака и привести к длительной клинических ответов в более чем 20% больных7. Тем не менее не все пациенты ответчиков, стоимость лечения является высокой, и эти процедуры являются токсичными, приводит к потенциальные серьезные аутоиммунных как побочные эффекты. Таким образом текущий задача заключается в определении прогнозных маркеров для этих новых immunotherapies. Соотнести с клинической реакции были зарегистрированы темпы мутаций в опухоли, выражение PD-L1 или уровней внутриопухолевых CD8+ Т-клеток инфильтрата. Однако эта Ассоциация еще слишком слаб, чтобы рекомендовать использование этих клинических биомаркеров в клинической практике за исключением компаньона тест для PD-L1 до отправления Pembrolizumab в немелкоклеточного легких рака легкого (НМРЛ) пациентов8 ,9,1011,12. Доказано, что Сопредседатель выражение многих рецепторов ингибирующих как PD-1, Тим-3, ЛАГ-3, и CTLA-4, индуцирует ячейки истощение фенотипа и устойчивость к терапии13,14,15. Так как периферической крови не является представителем микроокружения опухоли, он представляет большой интерес для анализа Фенотипические особенности клеток в situ. PD-1 и Тим-3 совместно выражая Т-клетки известны как функционально нарушениями клеток в нескольких контекстах13,16,17. В это исследование, прогнозные последствия совместного выражение двух рецепторов ингибирующих PD-1 и Тим-3 на CD8+ T оценивалась клетки.
Вверх до сих пор, изучая Сопредседатель выражение несколько маркеров на опухоли, проникнув лимфоцитов (Тилс) главным образом выполнялись cytometry анализ потока, что делает необходимым для работы на свежие опухоли и поэтому исключающие ретроспективный анализ. С обычными в situ окрашивание, только один пятная единовременно может быть выполнена, и характеристика типа клеток, которые совместно выражает маркеры не возможен. Например PD-L1 выражается многие типы клеток микроокружения опухолевых, что делает его трудно определить путем анализа обычных иммуногистохимии, какие ячейки, выражая PD-L1 более актуальны для корреляционного исследования. В этой работе, мы разработали инновационные в situ многопараметрических иммунофлюоресценции метод подсчета компьютер для корреляции со выражение PD-1 и Тим-3 опухоли, проникнув CD8+ Т-клеток с клинические исходы в РКЦ. Этот метод имеет ряд преимуществ, включая возможность для анализа на уровне одной ячейки и несколько маркеров в то же время с помощью многоспектральной камеры, которые могут захватить ограниченным интервалом > 10 Нм через жидкий кристалл фильтры18. Кроме того процедура является автоматической что позволяет воспроизводимость между оператором и сокращенный анализ по сравнению с методами руководства19. В области рака несколько исследований сообщалось, убедить несколько stainings молекул иммунной как PD-1, ПД-L1 и CD8 в Меркель клеточной карциномы, рака легких и головы и шеи рак20,21,22, 23. число автоматизированных ячеек возможна с подготовки пользователем (фенотип шаг). Флюоресценция измеряется в различных клеточных компартментов (ядер, цитоплазмы и мембраны).
Здесь, различные подмножества проникновения опухоли CD8+ T-клеток выражая PD-1 и/или Тим-3 в большой когорты РСС были подсчитаны и результаты коррелировали с параметрами выживания и тяжести клинической оценки. Было также можно анализировать интенсивности флуоресценции мембраны на сотовой резолюции с данными означают интенсивности флуоресценции (MFI) как в цитометрии. Насколько нам известно, это первый отчетности прогнозные результаты исследования с использованием этой многоспектральных изображений на основе фото технике.
Модификации и устранения неполадок:
Качество ткани является важным параметром; Он может легко проверяться окраской гематоксилином и эозином.
Одним из преимуществ этого метода является возможность мультиплексных stainings, но чтобы избежать распрос?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантов от Института национального du рака (ИНКОВ) (ET), le Лига против рака (ET), Университет Сорбонна Париж Сите (ET), НРУ (Selectimmunco) (ET), Labex иммуно-онкология (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). ЭДГ финансировался стипендий Fondation дуги. EV и CD финансировались братство APHP (биржа année исследований). ChB финансируется стипендий университета Сорбонна Париж Сите (contrat докторской). Авторы благодарят Bristol-Myers Squibb за их финансирование в этом проекте. Авторы благодарят Департамент патологии Hopital Européen Жоржа Помпиду и Некер (Laurianne Шамболь, Элоди Мишель и Жизель ЛЕГАЛЬ). Авторы благодарят гистология платформы PARCC, Hopital Européen Жоржа Помпиду (Corinne Lesaffre).
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
R software | https://www.r-project.org | ||
Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |