Este protocolo describe la cuantificación de múltiples citoquinas objetivos simultáneamente en sobrenadantes de cultivo de tejidos de esplenocitos de ratón estimulados usando grano multiplex inmunoensayo basado en la plataforma y un citómetro de flujo.
Los inmunoensayos basados en grano emplean el mismo principio básico como inmunoensayo de sándwich. Captura de cuentas, que se pueden distinguir por el tamaño y la intensidad de fluorescencia interna allophycocyanin (APC), se conjugan para anticuerpos específicos para un analito determinado. A continuación, un panel seleccionado de captura definido conjuntos de grano se incuba con una muestra biológica que contenga los analitos específicos de los anticuerpos de captura. Se añade un anticuerpo de detección biotinilado cóctel, que conduce a la formación de bocadillos de grano-analito-detección anticuerpo de captura.
Por último, se añade estreptavidina-ficoeritrina (PE-SA), que se une a los anticuerpos de detección biotinilado, proporcionando intensidades de la señal fluorescente en proporción a la cantidad de analito límite. El PE fluorescente señal de regiones específicas del analito granos se cuantifica mediante citometría de flujo y las concentraciones de analitos particular se determinan usando software de análisis de datos y la curva estándar generada en el ensayo.
En este experimento, utilizamos un panel ratón T helper citoquinas simultáneamente cuantificar la concentración de 13 objetivos separados del cytokine en sobrenadantes de cultivo de tejidos de esplenocitos de ratón cultivadas bajo diferentes condiciones de estimulación.
En su papel como moléculas de señalización solubles, citocinas median los procesos altamente coordinados y multifactoriales que regulan las respuestas inmunológicas de host. Se expresan en todas las fases del proceso inflamatorio, de iniciación a la resolución y regular una red de interacción compleja que incluye su propia síntesis y la de sus receptores celulares1. Esta red de comunicación se acoda con una complejidad que va más allá de las relaciones sinérgicas o antagónicas que puedan existir entre los componentes individuales. De hecho, muchas citocinas son conocidos a compartir funciones redundantes o por lo menos parcialmente superpuestos2,3.
Enfoques de Biología de sistemas integrados que cuantifican simultáneamente múltiples analitos del cytokine actualmente ofrecen una comprensión cada vez más amplia de la cytokinomes único que orquestar la respuesta inmune subyacente enfermedad de múltiples Estados4,5. Estos Estados de enfermedad van desde inflamación generalizada y cáncer, las afecciones neuro-degenerativas, enfermedades cardiovasculares6,7,8,9.
Tales redes de citoquinas pueden ser interrogados con eficacia usando inmunoensayos basados en grano LEGENDplex. Estos ensayos se basan en el mismo principio que el sándwich genitals del ensayo (ELISA) y utilizan microesferas codificada de la fluorescencia con anticuerpos de captura covalentemente Unidos a su superficie. Estos anticuerpos se inmovilizan en superficies mucho menores que los requeridos por los formatos tradicionales de ELISA. Esto permite que dichos ensayos se realizará con mucho menos volumen de la muestra, mientras que al mismo tiempo reducir no vinculante y proporcionando multiplexado análisis de varios analitos.
El ensayo descrito en el presente Protocolo utiliza esta tecnología para cuantificar hasta 13 objetivos simultáneamente. Datos de este ensayo pueden obtenerse usando una amplia variedad de citómetros de flujo comúnmente disponibles y a diferencia de otros ensayos disponibles no requieren el uso de instrumentación para análisis específicos dedicado. Con un creciente catálogo de analito validado paneles, estos ensayos se han utilizado en varios proyectos de investigación biomédica10,11,de12,13.
Para demostrar la facilidad y utilidad del formato de ensayo, en este experimento que utilizamos un panel de citoquinas helper T de ratón para cuantificar 13 separar las concentraciones de citoquinas de sobrenadantes de cultivo de tejidos obtenidos de esplenocitos de ratón cultivadas bajo múltiples condiciones estimulantes. Además de sobrenadantes de cultivo de tejidos, este ensayo también se puede realizar utilizando muestras de suero o plasma.
Puede proporcionar el formato de ensayo descrito en el presente Protocolo robusta cuantificación de perfiles mediador soluble en muestras biológicas que al experimentador tiene técnica de buen laboratorio y cumple con el protocolo recomendado.
Hay varios pasos fundamentales que deben seguirse para garantizar resultados confiables. En primer lugar, las normas recombinantes se debe reconstituir en tampon de ensayo el tiempo completo recomendado y después sólo diluida en tubos de polipropileno. Tubos de poliestireno pueden promover la adherencia de las proteínas en la pared de los tubos, que pueden conducir a las señales de baja cuando se genera la curva estándar. En segundo lugar, agitando durante los pasos de incubación adecuada es fundamental. Sin agitación adecuada, las características de unión de los granos de ensayo pueden ser seriamente obstaculizadas. Además, el lavado apropiado entre los pasos de incubación también se requiere. El experimentador debe asegurarse de que exceso reactivos se extraen de los pozos antes de comenzar el siguiente paso en el protocolo. Configuración de instrumentos para el citómetro de flujo utilizado para cuestionar las cuentas de ensayo debe optimizarse así. En particular, valores de PMT se deben ajustar para asegurar la separación adecuada del grano y amplio rango dinámico de las curvas estándar. Finalmente, justo antes de que se analizan en el citómetro, granos debe agitarse para asegurar la suspensión adecuada y para evitar la formación de agregados que pueden sesgar los resultados.
Potencialmente, este protocolo puede ser modificado para analizar homogenados de tejido, así como los tipos de muestra en este manuscrito, siempre y cuando el investigador está dispuesto a optimizar su Protocolo de lisis antes de realizar ensayos de placa grande, completo. La técnica real por supuesto variará dependiendo del tipo de tejido; sin embargo, en general el protocolo debe usar un tampón de pH neutro que contiene concentraciones fisiológicas de sales iónicas, ningunos productos químicos desnaturalización y preferiblemente sin detergentes. Si se debe usar detergente, concentraciones de detergente no iónico deben mantenerse a un mínimo (por ejemplo, no más del 1%). El búfer debe contener también inhibidores de la proteasa suficiente para evitar la degradación proteolítica de proteínas de la blanco. Sin importar el protocolo de lisis utilizado, los preparativos finales deben centrifugarse para retirar las partículas antes del análisis.
En cuanto a limitaciones del análisis, las concentraciones de analito objetivos tipos de muestra biológica pueden variar mucho. Para cuantificar adecuadamente las concentraciones de analito, debe caer dentro de los valores superior e inferior de la curva estándar. Extrapolación de los valores de la curva no es necesariamente confiable y no se recomienda. Los investigadores por lo tanto deben optimizar las diluciones de las muestras de concretas en experiencias piloto antes de ejecutar un análisis completo de la placa. Además, la cuidadosa preparación de las muestras biológicas a ensayarse es fundamental para el éxito de este formato de ensayo. Las muestras lipémicas, hemolizadas o contienen residuos de proteínas afectan las interacciones de anticuerpos de antígenos que definen el principio fundamental de este inmunoensayo y hacer que los resultados no interpretables.
Este análisis es importante con respecto a los métodos existentes de cuantificación por varias razones. Cuando se ejecuta correctamente, el formato de ensayo puede cuantificar hasta 13 analitos de una muestra usando volúmenes mucho más pequeños que sería necesario analizar la muestra utilizando tradicionales ensayos de ELISA. Este formato de ensayo también no requiere instrumentación dedicada para llevar a cabo. Esto es una ventaja en comparación con otros inmunoensayos basados en grano disponibles en el mercado como el ensayo se puede ejecutar utilizando cualquier número de citómetros de flujo utilizado.
Investigación científica sobre el papel había jugado por citoquinas y factores secretados redes en salud y la enfermedad se está expandiendo. El formato de ensayo descrito en este manuscrito puede ser una herramienta valiosa para los investigadores tratando de entender estos fenómenos complejos y multifacéticos. Programas activos de investigación biomédica están comenzando a explorar el papel de las redes de citocinas en no sólo áreas generalizadas tales como inflamación6, sino también en el contexto de Estados de enfermedad específica como la aterosclerosis, el cáncer y la neuroinflamación 1516,de,17. Sin duda, investigación seguirá creciendo en estas áreas como la búsqueda de nuevas terapias tratar estas condiciones crónicas se expande. La necesidad de cuantificación precisa y fiable de los mediadores solubles asociada a estas enfermedades seguirá siendo una prioridad de investigación crítica.
The authors have nothing to disclose.
Los autores quisieran agradecer las contribuciones de los inmuno-ensayos y equipo de desarrollo de producto para el desarrollo del ensayo. Además, nos gustaría agradecer a Vigene Tech, Inc. por su colaboración en el diseño de los paquetes de software de análisis de datos.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |