ويصف هذا البروتوكول التحديد الكمي لأهداف سيتوكين متعددة في وقت واحد في supernatants ثقافة الأنسجة التي تم جمعها من سبلينوسيتيس الماوس حفز استخدام حبة متعدد المناعة استناداً إلى النظام الأساسي وسيتوميتير تدفق.
تحديدكم المستندة إلى حبة تستخدم نفس المبدأ الأساسي تحديدكم ساندويتش. التقاط الخرز، التي يمكن أن تكون متباينة من حيث الحجم والكثافة الأسفار الداخلية اللوفيكوسيانين (APC)، وهي مترافق للأجسام المضادة المحددة إلى أكثر خاصة. وبعد ذلك، هو المحتضنة لوحة مختارة من مجموعات حبة التقاط محددة مع عينة بيولوجية تحتوي على تحليلها المستهدفة المحددة لالتقاط الأجسام المضادة. يتم إضافة جسم كشف بيوتينيلاتيد كوكتيل، الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل التقاط السندوتشات حبة-أكثر-كشف الأجسام المضادة.
وأخيراً، إضافة ستريبتافيدين-فيكوريثرين (SA-PE)، الذي يربط بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة، توفير كثافات الفلورسنت إشارة ما يتناسب مع كمية أكثر منضم. PE الفلورسنت إشارة مناطق الخرز أكثر حدة هو كمياً استخدام التدفق الخلوي، وتركيزات معينة تحليلها مصممون على استخدام برمجيات تحليل البيانات والمنحنى المعياري ولدت في المقايسة.
في هذه التجربة، نحن نستخدم لوحة سيتوكين مساعد تي ماوس لقياس تركيز 13 أهداف سيتوكين منفصلة في supernatants ثقافة الأنسجة التي تم جمعها من الماوس سبلينوسيتيس مثقف تحت مختلف الظروف تنشيطية في وقت واحد.
في دورها كجزيئات إرسال الإشارات للذوبان، السيتوكينات التوسط في عمليات منسقة للغاية والمتعددة العوامل التي تحكم المضيف الاستجابات المناعية. أنها يتم التعبير عنها من خلال جميع مراحل عملية تحريضية، من البدء بالقرار، وتنظيم شبكة تفاعل معقد الذي يشمل التوليف الخاصة بهم، وأن تلك المستقبلات الخلوية1. شبكة الاتصالات هذه الطبقات مع تعقيد الذي يذهب إلى أبعد من علاقات التآزر أو العدائية التي قد تكون موجودة بين المكونات الفردية. وفي الواقع، معروفة السيتوكينات العديد من تقاسم الوظائف الزائدة عن الحاجة أو متداخلة جزئيا على الأقل2،3.
النهج بيولوجيا النظم المتكاملة التي كمياً تحليلها سيتوكين متعددة في نفس الوقت تقوم حاليا بتوفير فهم شامل متزايد سيتوكينوميس الفريدة التي تنسق الاستجابات المناعية الكامنة وراء المرض متعددة الدول4،5. هذه المرض الدول مجموعة من التهاب المعمم للسرطان والشروط التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية6،7،،من89.
يمكن استجوابهم هذه الشبكات سيتوكين فعالية استخدام تحديدكم المستندة إلى حبة ليجيندبليكس. هذه الاختبارات تستند على نفس المبدأ ساندويتش Enzyme-Linked المرتبط بالانزيم (ELISA)، واستخدام fluorescence ترميز الجزئي المجالات الخرز الصغير بالتقاط الأجسام المضادة تساهمي تعلق على سطحها. هذه الأجسام المضادة هي المعطل تداولها في المناطق السطحية أصغر بكثير من تلك التي يتطلبها التقليدية أليسا تنسيقات. وهذا يتيح هذه الاختبارات تتم مع أقل بكثير من حجم العينة، بينما في الوقت نفسه الحد غير محددة ملزمة وتوفير متعدد تحليل لتحليلها عدة.
الفحص المبينة في هذا البروتوكول يستخدم هذه التكنولوجيا قوانتيتاتي تصل إلى 13 أهداف في وقت واحد. البيانات المستمدة من هذا التحليل يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعة متنوعة من سيتوميتيرس تدفق المتاحة عموما، وعلى عكس الاختبارات الأخرى المتاحة لا تتطلب استخدام الأجهزة الخاصة بفحص مخصص. مع ملف كتالوج الآخذة في اتساع من لوحات أكثر تم التحقق من صحتها، استخدمت هذه الاختبارات في عدة البحوث الطبية الحيوية الجارية مشاريع10،11،،من1213.
للبرهنة على سهولة وفائدة تنسيق المقايسة، في هذه التجربة نستخدم لوحة سيتوكين مساعد “تي الماوس” إلى كوانتيتاتي فصل 13 تركيزات سيتوكين من supernatants ثقافة الأنسجة التي تم الحصول عليها من سبلينوسيتيس الماوس مثقف تحت متعددة شروط محفزة. بالإضافة إلى زراعة الأنسجة سوبيرناتانتس، هذا التحليل يمكن أيضا إجراء باستخدام عينات المصل أو البلازما.
شكل الإنزيم الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن أن توفر الكمي قوية للملامح وسيط قابل للذوبان في العينات البيولوجية التي قدمت المجرب قد تقنية المختبرات الجيدة وتلتزم بالبروتوكول الموصى بها.
وهناك العديد من الخطوات الأساسية التي ينبغي اتباعها من أجل ضمان نتائج موثوقة. أولاً، يجب أن يسمح بمعايير المؤتلف إعادة تشكيل في المخزن المؤقت للمقايسة كامل الوقت الموصى بها، وبعد إلا تضعف في أنابيب البولي بروبلين. أنابيب البوليستيرين يمكن تعزيز التمسك بالبروتينات الجدار الأنابيب، مما يمكن أن يؤدي إلى إشارات منخفضة عند إنشاء المنحنى المعياري. ثانيا، تهتز أثناء حضانة الخطوات المناسبة أمر بالغ الأهمية. دون الانفعالات المناسبة، يمكن أن تعوق شدة خصائص ربط الخرز المقايسة. وباﻹضافة إلى ذلك، الغسيل المناسبة بين الخطوات حضانة مطلوب أيضا. يجب ضمان المجرب إزالة الكواشف الزائدة من الآبار قبل البدء في الخطوة التالية في البروتوكول. يجب أن يكون الأمثل إعدادات الصكوك cytometer تدفق المستخدمة في استجواب الخرز المقايسة كذلك. على وجه الخصوص، يجب تعديل إعدادات PMT لضمان الفصل السليم حبة ونطاقات دينامية واسعة النطاق للمنحنيات القياسية. أخيرا، يجب أن حبات فقط قبل يجري تحليله في سيتوميتير، فورتيكسيد لضمان تعليق مناسب وتجنب تشكيل المجاميع التي يمكن أن تحرف النتائج.
يمكن تعديل هذا البروتوكول يحتمل أن تكون لتحليل الأنسجة هوموجيناتيس، فضلا عن أنواع نموذج بحث في هذه المخطوطة، شريطة الباحث على استعداد لتحسين بروتوكول تحلل بها قبل إجراء فحوصات لوحة كبيرة وكاملة. تقنية الفعلية تختلف بطبيعة الحال تبعاً لنوع النسيج؛ ومع ذلك، عموما البروتوكول ينبغي استخدام المخزن مؤقت الأس الهيدروجيني محايدة المحتوية على تركيزات فسيولوجية من الأملاح الأيونية، لا المواد الكيميائية يشوه، ويفضل أن لا المنظفات. إذا كان يجب استخدام المنظفات، ينبغي أن يظل تركيز المنظفات غير الأيونية كحد أدنى (مثلاً لا يزيد عن 1 في المائة). المخزن المؤقت ينبغي أن تتضمن أيضا مثبطات البروتياز كافية لمنع تدهور proteolytic البروتينات المستهدفة. بغض النظر عن تحلل البروتوكول المستخدم، يجب تثفيل الاستعدادات النهائية لإزالة الجسيمات قبل التحليل.
فيما يتعلق بالقيود المقايسة، تركيزات أهدافا أكثر في أنواع العينات البيولوجية يمكن أن تختلف إلى حد كبير. من أجل قياس تركيزات أكثر بشكل صحيح، يجب أن تندرج ضمن القيم العلوية والسفلية للمنحنى المعياري. استقراء قيم المنحنى ليست موثوقة بالضرورة، ولا يوصي. المحققين ولذلك يجب تحسين تخفيف تلك العينات خاصة في تجارب نموذجية قبل أن يعمل فحص الكامل–لوحة. وباﻹضافة إلى ذلك، التحضير الدقيق للعينات البيولوجية تكون جزيئي أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الشكل المقايسة. عينات ليبيميك أو هيموليزيد، أو تحتوي على بروتين الحطام سوف تؤثر على جسم مستضد التفاعلات التي تحدد المبدأ الأساسي لهذه المناعة، وتقديم النتائج التي يتم أونينتيربريتابل.
هذا الفحص هام فيما يتعلق بالأساليب القائمة على القياس الكمي لعدة أسباب. عند تشغيل بشكل صحيح، يمكن أن قوانتيتاتي شكل الإنزيم تحليلها تصل إلى 13 من عينة استخدام كميات أقل بكثير مما ستكون هناك حاجة تحليل العينة باستخدام فحوصات أليسا التقليدية. تنسيق هذا التحليل أيضا لا تتطلب الأجهزة مخصصة من أجل إجراء. هذه ميزة مقارنة الأخرى المتاحة تجارياً تحديدكم المستندة إلى حبة كما يمكن تشغيل الفحص استخدام أي عدد من سيتوميتيرس تدفق استخداماً.
التحقيق العلمي في الدور الذي تقوم به العوامل يفرزها وسيتوكين الشبكات في الصحة والمرض أخذ في التوسع. تنسيق التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة يمكن أن يكون أداة قيمة للباحثين تسعى إلى فهم هذه الظواهر معقدة ومتعددة الجوانب. بدأت برامج البحوث الطبية البيولوجية النشطة لاستكشاف دور شبكات سيتوكين في ليس فقط المناطق المعمم مثل التهاب6، ولكن أيضا في سياق الدول أمراض محددة مثل تصلب الشرايين والسرطان ونيوروينفلاميشن 1516،،17. مما لا شك فيه، سوف يواصل التحقيق تنمو في هذه المناطق كما يوسع البحث عن علاجات جديدة لعلاج هذه الحالات المزمنة. الحاجة إلى التقدير الكمي دقيقة وموثوق بها للوسطاء للذوبان المرتبطة بهذه الأمراض سوف تظل أولوية حاسمة لبحث.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون الاعتراف بالمساهمات من المؤشرات الحيوية والمناعية-فحوصات فريق “تطوير المنتج” لتنمية المقايسة. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر تك فيجيني, Inc. للجهود التعاونية في تصميم حزم برامج تحليل البيانات.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |