Este protocolo descreve a quantificação de alvos múltiplos de citocinas simultaneamente em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de rato estimulada splenocytes usando multiplex do grânulo imunoensaio baseado em plataforma e um citômetro de fluxo.
Imunoensaios baseados em grânulo empregam o mesmo princípio básico como imunoensaios de sanduíche. Captura de grânulos, que podem ser diferenciados pelo tamanho e intensidade de fluorescência allophycocyanin interno (APC), são conjugados com anticorpos específicos para um determinado analito. Em seguida, um painel selecionado de captura definidos conjuntos de grânulo é incubado com uma amostra biológica contendo alvo analitos específicos para os anticorpos de captura. Um anticorpo de detecção biotinilado cocktail é adicionado, o que leva à formação de sanduíches de anticorpo do grânulo-analito-deteção de captura.
Finalmente, é adicionado streptavidin-ficoeritrina (SA-PE), que liga-se anticorpos de deteção biotinilado, fornecendo intensidades de sinal fluorescente proporcionalmente à quantidade de analito acoplado. O PE fluorescente sinal de regiões específicas do analito grânulos é quantificada usando citometria de fluxo, e as concentrações dos analitos específicos são determinadas usando software de análise de dados e a curva padrão gerado no ensaio.
Neste experimento, usamos um painel de cytokine do rato T auxiliar para quantificar simultaneamente a concentração de 13 destinos de cytokine separado em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de rato splenocytes cultivadas sob diferentes condições estimulatórios.
Em seu papel como moléculas sinalizadoras solúveis, citocinas mediam os processos altamente coordenados e multifatoriais que governam as respostas imunológicas do hospedeiro. Eles são expressos durante todas as fases do processo inflamatório, de iniciação à resolução e regulam uma rede de interação complexa que inclui sua própria síntese e dos seus receptores celulares1. Esta rede de comunicação é mergulhado com uma complexidade que ultrapassa as relações sinérgicas ou antagônicas que possam existir entre componentes individuais. Com efeito, muitas citocinas são conhecidas para compartilhar funções redundantes ou pelo menos parcialmente sobrepostas2,3.
Abordagens de biologia de sistemas integrados que quantificam simultaneamente vários analitos de citocinas são, atualmente, fornecendo uma compreensão cada vez mais abrangente do único cytokinomes que orquestrar as respostas imunes subjacente a várias doenças 4,5, afirma. Estas doenças Estados variam de inflamação generalizada para câncer, doenças neuro-degenerativas e doenças cardiovasculares6,7,8,9.
Essas redes de citocina podem ser interrogadas eficazmente usando os imunoensaios baseados no grânulo de LEGENDplex. Estes ensaios são baseados no mesmo princípio que o sanduíche do ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA) e usam microesferas de fluorescência codificada com captura de anticorpos ligados covalentemente a sua superfície. Estes anticorpos são imobilizados na áreas de superfície muito menores do que os exigidos pelos formatos tradicionais de ELISA. Isso permite que tais ensaios ser executado com muito menos volume de amostra, enquanto ao mesmo tempo reduzir específico vinculação e fornecendo multiplexado análise de vários analitos.
O ensaio descrito neste protocolo utiliza esta tecnologia para dosar até 13 alvos simultaneamente. Dados deste ensaio podem ser obtidos usando uma grande variedade de citômetros comumente disponíveis e ao contrário de outros ensaios disponíveis não requer o uso de instrumentação de ensaio específico dedicado. Com um catálogo de expansão dos painéis de analito validado, estes ensaios têm sido usados em pesquisa biomédica em curso vários projectos10,11,12,13.
Para demonstrar a facilidade e a utilidade do formato de ensaio, neste experimento, que usamos um painel de citocina Mouse T auxiliar para dosar 13 separar concentrações de citocinas sobrenadantes de cultura de tecidos obtidos a partir do mouse splenocytes cultivadas sob múltiplos estimulatórios condições. Além de cultura de tecidos sobrenadantes, este ensaio também pode ser realizado utilizando amostras de soro ou plasma.
O formato de ensaio descrito neste protocolo pode fornecer robusta quantificação dos perfis de mediador solúvel em amostras biológicas, desde que o experimentador tem laboratório de boa técnica e adere ao protocolo recomendado.
Há várias etapas que devem ser seguidas para garantir resultados confiáveis. Em primeiro lugar, as normas recombinantes devem reconstituir no buffer de ensaio o recomendado em tempo integral e após apenas diluído em tubos de polipropileno. Tubos de poliestireno podem promover a adesão das proteínas da parede dos tubos, que pode levar a sinais de baixos ao gerar a curva padrão. Em segundo lugar, adequada a tremer durante as etapas de incubação é crítico. Sem a agitação adequada, as características de ligação dos grânulos do ensaio podem ser severamente prejudicadas. Além disso, a lavagem adequada entre as etapas de incubação também é necessária. O experimentador deve assegurar que os reagentes em excesso são removidos dos poços, antes de iniciar o próximo passo no protocolo. Configurações de instrumentos para o citômetro de fluxo usado para interrogar os grânulos de ensaio devem ser também otimizadas. Em particular, configurações de PGTO devem ser ajustadas para assegurar a separação adequada do grânulo e amplos intervalos dinâmicos para as curvas padrão. Finalmente, pouco antes de ser analisado sobre o citômetro, grânulos devem ser vortexed para garantir a suspensão adequada e para evitar a formação de agregados que podem distorcer os resultados.
Este protocolo potencialmente pode ser modificado para analisar o tecido homogenates, bem como os tipos de amostra discutidos neste manuscrito, desde que o pesquisador está disposto otimizar seu protocolo de Lise antes de realizar ensaios de placa grande, completo. Claro, a técnica real irá variar dependendo do tipo de tecido; no entanto, em geral o protocolo deve usar um tampão de pH neutro contendo concentrações fisiológicas de sais iônicos, sem produtos químicos desnaturação e de preferência sem detergentes. Se o detergente deve ser usado, as concentrações de detergente não-iônico devem ser mantidas no mínimo (por exemplo, não mais que 1%). O buffer também deve conter inibidores de protease suficientes para prevenir a degradação proteolítica de proteínas do alvo. Independentemente do protocolo de Lise usado, os preparativos finais devem ser centrifugados para remover partículas antes da análise.
Sobre as limitações do ensaio, as concentrações de analito alvos em tipos de amostra biológica podem variar muito. De forma a quantificar corretamente as concentrações de analito, eles devem ser abrangidos os valores superior e inferior para a curva padrão. Extrapolação dos valores da curva não é necessariamente fiável e não recomendo. Investigadores, portanto, devem otimizar as diluições de amostras particulares em experimentos piloto antes da execução de um ensaio completo-placa. Além disso, a preparação cuidadosa das amostras biológicas para ser analisada é fundamental para o sucesso deste formato de ensaio. Amostras lipémicas, hemolizado, ou contêm restos de proteínas irão afetar interações antígeno anticorpo que definem o princípio básico deste imunoensaio e render resultados que são difíceis de interpretar.
Este ensaio é significativo no que diz respeito a métodos de quantificação existentes por várias razões. Quando executado corretamente, o formato de ensaio pode dosar até 13 analitos de uma amostra usando volumes muito menores do que seria necessário para analisar a amostra usando os tradicionais ensaios de ELISA. Este formato de ensaio também não requer instrumentação dedicada para ser executada. Esta é uma vantagem em comparação com outros imunoensaios baseados em grânulo comercialmente disponíveis como o ensaio pode ser executado usando qualquer número de citômetros comumente usados.
Inquérito científico sobre o papel desempenhado por citocinas e fatores secretados redes em saúde e doença está se expandindo. O formato de ensaio descrito neste manuscrito pode ser uma ferramenta valiosa para investigadores que pretendam compreender esses fenômenos multifacetados e complexos. Programas de investigação biomédica estão começando a explorar o papel das redes de citocina de inflamação de áreas tais como generalizadas não apenas6, mas também no contexto de Estados de doença específica, tais como aterosclerose, câncer e neuroinflammation 15,16,17. Sem dúvida, investigação continuará a crescer nestas áreas, como a busca de novas terapêuticas tratar essas condições crônicas se expande. A necessidade de quantificação precisa e confiável dos mediadores solúveis associados a estas doenças continuará a ser uma prioridade de investigação crítica.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria de reconhecer as contribuições dos biomarcadores e imuno-ensaios de equipe de desenvolvimento de produto para o desenvolvimento do ensaio. Além disso, gostaríamos de agradecer Vigene Tech, Inc. para seus esforços de colaboração na criação de pacotes de software de análise de dados.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |