Summary

Libreria del Peptide per mappare gli epitopi di Qa-1 in una proteina di sovrapposizione

Published: December 20, 2017
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Summary

QA-1 (HLA-E nell’uomo) appartiene ad un gruppo di molecole complesse 1b non classici di istocompatibilità. Immunizzazione con gli epitopi Qa-1-associazione ha dimostrato di aumentare la regolazione immunitaria tessuto-specifici e migliorare diverse malattie autoimmuni. Qui descriviamo una strategia di libreria del peptide sovrapposti per l’identificazione di epitopi di Qa-1 in una proteina.

Abstract

QA-1 (HLA-E nell’uomo) appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib). Dati recenti suggeriscono che Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante in rilievo le cellule per l’integrità strutturale e funzionale, inducendo la regolazione immunitaria e limitando la risposta immunitaria alle infezioni virali. Inoltre, l’aumento funzionale della Qa-1-restricted CD8+ T cellule tramite epitopo immunizzazione ha mostrato effetti terapeutici in diversi modelli animali di malattia autoimmune, ad esempio l’encefalomielite allergica sperimentale, l’artrite indotta da collagene e diabete non obesi. Di conseguenza, c’è un urgente bisogno di un metodo che può efficacemente e rapidamente identificare gli epitopi in una proteina funzionali-Qa-1. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza Qa-1-restricted CD8+ cellula T linee specifiche per una libreria peptidica (OLP) sovrapposti per determinare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. Questa libreria OLP contiene peptidi sovrapposti 15-mer che coprono tutta la lunghezza di una proteina, e peptidi adiacenti si sovrappongono da 11 aminoacidi. Usando questo protocollo, abbiamo recentemente identificato un epitopo di Qa-1 9-mer alla della glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG). Questo appena mappata epitopo di MOG Qa-1 è stato indicato per indurre CD8 epitopo specifico, Qa-1-restricted+ T cellule che una maggiore regolazione immunitaria mielina specifici. Di conseguenza, questo protocollo è utile per la ricerca futura di nuovi bersagli e funzioni di Qa-1-restricted CD8+ T cellule.

Introduction

QA-1 appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib) in topi. Suo omologo umano è HLA-E. La prova precedente ha dimostrato che le molecole di Qa-1 hanno importanti funzioni biologiche. In primo luogo, Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante nel rilevamento topografico di cellule per integrità strutturale e funzionale. A questo proposito, Qa-1 molecole hanno evoluto strategie diverse per monitorare la funzione normale di una cella. Una tale strategia consente Qa-1 molecole per formare complessi con un peptide leader trasformati (epitopo), cioè il Qa-1 determinante modificatore (Qdm) che viene elaborato da molecole di MHC-Ia classiche nel reticolo endoplasmatico1. Questi complessi di Qa-1/Qdm successivamente visualizzano sulla superficie di una cellula e associare a recettori inibitori NKG2A sulle cellule NK per inibire NK uccidendo attività2. Se l’espressione di molecole MHC-Ia è perduto, una cella (ad es. una cellula maligna) diventa sensibile alla NK uccidendo2. L’altra strategia consente Qa-1 molecole per formare nuovi complessi di Qa-1/epitopo sulla superficie di una cellula che è carente in TAP (trasportatore associate all’elaborazione dell’antigene)3 e/o ERAAP (reticolo endoplasmico aminopeptidasi associati elaborazione dell’antigene)4 (entrambe le carenze si verificano spesso in cellule maligne). La cellula che esprime questi nuovi complessi di Qa-1/epitopo può quindi essere riconosciuta ed eliminata dall’epitopo specifico Qa-1-restricted CD8+ T cellule. In secondo luogo, Qa-1 molecole inducono regolazione immunitaria5. A questo proposito, Qa-1/epitopo complessi sono stati indicati per stimolare CD8+ cellule regolarici di T (Treg) che sono importanti per la prevenzione del danno immune-mediato di auto-tessuti6,7,8 ,9,10. In terzo luogo, Qa-1-restricted CD8+ Treg cellule sono state indicate per limitare le risposte immunitarie contro l’infezione virale11.

Pertanto, l’incremento specifico di epitopo specifico Qa-1-restrictred CD8+ T cellule è una strategia potenzialmente promettente per l’eliminazione delle cellule anormali, per il miglioramento della regolazione immune e per il controllo dell’entità del risposte immunitarie indotta da virus. Mentre esso non è stato determinato se l’incremento di epitopo specifico Qa-1-restricted CD8+ T cellule possono aumentare la sorveglianza immune e limitare le risposte immunitarie indotta da virus, i nostri laboratori e altri hanno dimostrato chiaramente che immunizzazione con gli epitopi Qa-1 può aumentare la funzione di Qa-1-restricted CD8+ Treg cellule specifiche per patogeni autoimmuni CD4+ T cellule, con conseguente controllo efficiente di CD4+ malattie autoimmuni T cellulo-mediata in un modelli di varietà di animali come encefalomielite allergica sperimentale (un modello animale della sclerosi multipla umana)6,10, artrite indotta da collagene (un modello animale dell’artrite reumatoide umana)7, e diabete non obesi (un modello animale del diabete di tipo 1 umano)8. Inoltre, abbiamo scoperto che l’immunizzazione con un epitopo di Qa-1 tessuto-specifici conduce al controllo specifico di infiammazione immune-mediata in quel tessuto attraverso l’aumento di CD8+ Treg cells12. I successi precedenti studi preclinici indicano la necessità di una valutazione completa di immunizzazione di epitopo Qa-1 per il trattamento di malattie immuno-mediate di tessuto-specifici e, potenzialmente, per la terapia di altre malattie connesse con le mancanze nel rubinetto e ERAAP.

Di conseguenza, esiste una domanda per una tecnologia che può attendibilmente e rapidamente analizzare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. A questo proposito, è stato descritto un numero limitato di epitopi Qa-1 biologicamente importanti. La maggior parte di questi epitopi di Qa-1 sono stata identificata serendipitously durante lo studio di CD8+ T cell responses to batteri13, le cellule carenti di rubinetto3, le cellule carenti di ERAAP4e le cellule che causano EAE6, 9. Pertanto, una tecnica di elevato throughput è auspicabile per l’identificazione di epitopi di Qa-1 biologicamente importanti in una proteina definita. Di seguito descriviamo una strategia di libreria del peptide (OLP) sovrapposti che esegue il mapping funzionali epitopi di Qa-1 in una proteina usando CD8 Qa-1-resrticted+ cellula T linee specifiche per il pool di OLP (OLP_pool) di una proteina.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con un protocollo di utilizzo approvato dal comitato di impiego presso l’Università del Texas a El Paso e Loma Linda University e cura degli animali e istituzionali Animal Care. 1. generazione di una libreria OLP che coprono l’intera lunghezza di una proteina Progettare una libreria OLP in cui tutti i peptidi sono 15-mer in lunghezza, e peptidi adiacenti si sovrappongono da 11 aminoacidi.Nota: Nello studio MOG OLP, sequenza…

Representative Results

Progettazione di una libreria OLP che coprono l’intera lunghezza di una proteina All’inizio del N-terminale di una proteina, ogni peptide è 15 aminoacidi (15-mer). Quindi, il primo peptide si estende su posizione 1 alla posizione 15. N-terminale del peptide secondo si sovrappone con il C-terminale del peptide primo da 11 aminoacidi. Quindi, il secondo peptide si estende dalla posizione 5 alla posizione 19. Progettare il resto dei …

Discussion

Qui, abbiamo descritto un protocollo per l’analisi di epitopi di Qa-1 in una proteina. In relazione al presente protocollo, parecchie altre strategie inoltre sono state segnalate precedentemente. In primo luogo, trapianto allogeneic CD8+ linee a cellula T e i cloni sono stati usati per l’identificazione del Qdm1. In secondo luogo, un motivo di Qa-1-legante presunto dall’analisi di Qdm è stato utilizzato per l’identificazione di HSP60p216-224 e un epitopo TCRBV8.19</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Penelope Garcia per la sua assistenza tecnica e la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un Grant di ricerca innovazione (RIG) dal dipartimento di medicina all’Università di Loma Linda (681205-2967) e un pilota grant dal National Multiple Sclerosis Society (PP1685) a XT.

Materials

The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

References

  1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
  2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
  3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
  4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
  5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
  6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
  7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
  8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
  9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
  10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
  11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
  12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
  13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
  14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
  15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
  16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
  18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
  19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
  20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
  21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

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Cite This Article
Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

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