Überlappende Peptid-Bibliothek zuordnen Qa-1 Epitope in einem Protein
Summary
QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b Moleküle. Immunisierung mit QS-1-Bindung Epitope nachweislich erweitern gewebespezifischen Immunregulation und mehrere Autoimmunerkrankungen zu verbessern. Hier beschreiben wir eine überlappende Peptid Bibliothek Strategie zur Identifikation des Qa-1 Epitope in ein Protein.
Abstract
QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle. Aktuellen Daten geht hervor, dass QS-1-Molekülen in Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität Vermessung, induzierende Immunregulation und Begrenzung der Immunantwort auf virale Infektionen eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus funktionale Augmentation des QS-1-eingeschränkt CD8+ T-Zellen durch Epitop Immunisierung hat therapeutische Effekte in mehreren Autoimmunerkrankung Tiermodellen, z.B. experimentelle allergische Enzephalomyelitis gezeigt Kollagen-induzierte Arthritis und nicht adipösen Diabetes. Daher gibt es eine dringende Notwendigkeit für eine Methode, die schnell und effizient funktionelle QS-1-Epitope in einem Protein identifizieren kann. Hier beschreiben wir eine Protokoll, das QS-1-eingeschränkt CD8 nutzt+ T-Zell-Linien für eine überlappende Peptid (OLP)-Bibliothek für die Bestimmung der QS-1 Epitope in einem Protein spezifisch. Diese OLP-Bibliothek enthält 15-Mer überlappende Peptide, die die gesamte Länge eines Proteins zu decken, und angrenzenden Peptide eine Überlappung von 11 Aminosäuren. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir vor kurzem eine 9-Mer Qa-1 Epitop in Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) identifiziert. Diese neu zugeordnete MOG QS-1-Epitop zeigte sich Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt CD8 induzieren+ T-Zellen, dass verbesserte Myelin-spezifische Immunregulation. Daher eignet sich dieses Protokoll für zukünftige Untersuchung neuartiger Ziele und Funktionen des QS-1-eingeschränkt CD8+ T Zellen.
Introduction
QS-1 gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle in den Mäusen. Seine menschliche Homolog ist HLA-E. Vorherigen Nachweis hat gezeigt, dass QS-1-Moleküle wichtige biologische Funktionen haben. Erstens, QS-1-Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Vermessung Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität. QS-1-Moleküle haben in diesem Zusammenhang mehrere Strategien, um die normale Funktion einer Zelle überwachen entwickelt. Eine solche Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu Form-komplexe mit einer verarbeiteten Führer Peptid (Epitop), d.h. der QS-1 Determinante Modifikator (Qdm), die von klassischen MHC-Ia-Moleküle in das endoplasmatische Retikulum1verarbeitet wird. Diese QS-1/Qdm komplexe später auf der Oberfläche einer Zelle anzeigen und binden an hemmenden NKG2A Rezeptoren auf NK-Zellen, NK Aktivität2töten zu hemmen. Wenn die Expression von MHC-Ia Moleküle verloren geht, wird eine Zelle (z. B. eine maligne Zelle) empfindlich auf NK2töten. Die andere Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu bilden neue QS-1/Epitop komplexe auf der Oberfläche einer Zelle, die einen Mangel an TAP (Transporter mit Antigen Verarbeitung verbunden) ist3 und/oder ERAAP (endoplasmatische Retikulum Aminopeptidase zugeordnet Antigen Processing)4 (beide Mängel treten oft in bösartiger Zellen). Die Zelle, die diese neuen QS-1/Epitop komplexe drückt dann erkannt und eliminiert durch die Epitop-spezifischen CD8 QS-1-eingeschränkt werden kann+ T Zellen. Zweitens, induzieren QS-1-Moleküle Immunregulation5. In diesem Zusammenhang Qa-1/Epitop-komplexe haben gezeigt, dass CD8 stimulieren+ regulatorische (Treg) T-Zellen, die wichtig für die Vermeidung von immunvermittelte Schäden selbst-Gewebe6,7,8 ,9,10. Drittens, QS-1-eingeschränkt CD8+ Treg Zellen gezeigt worden, haben um Immunantworten gegen virale Infektion11zu begrenzen.
Daher bestimmte Vermehrung der Epitop-spezifische QS-1-Restrictred CD8+ T Zellen ist eine potenziell vielversprechende Strategie für die Beseitigung von abnormen Zellen, für die Verbesserung der Immunregulation und für die Kontrolle des Ausmaßes der Virus-induzierte Immunantwort. Während es steht nicht fest ob Brustvergrößerung Epitop-spezifischer CD8 QS-1-eingeschränkt+ T Zellen erweitern Immunüberwachung und Virus-induzierte Immunantwort zu begrenzen können, unsere Labore und andere haben eindeutig gezeigt, dass Immunisierung mit QS-1 Epitope kann die Funktion des QS-1-eingeschränkt CD8 ergänzen+ Treg Zellen spezifische für pathogene autoimmune CD4+ T Zellen, führt zu effizienten Kontrolle von CD4+ T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen in eine Vielzahl von Tier-Modelle wie experimentelle allergische Enzephalomyelitis (Tiermodell der menschlichen multiplen Sklerose)6,10, Kollagen-induzierte Arthritis (einem Tiermodell der menschlichen rheumatoide Arthritis)7, und nicht adipösen Diabetes (Tiermodell für menschliche Typ 1 Diabetes)8. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass die Immunisierung mit einem gewebespezifischen Qa-1 Epitop führt zu spezifischen Kontrolle der immun-vermittelte Entzündung in diesem Gewebe durch Vermehrung der CD8+ Treg Zellen12. Die oben genannten Erfolge von präklinischen Studien zeigen eine Notwendigkeit für eine umfassende Bewertung der QS-1 Epitop Immunisierung für die Behandlung von gewebespezifischen immunvermittelte Erkrankungen und möglicherweise für die Behandlung von anderen Erkrankungen im Zusammenhang mit Mängeln in Hahn und ERAAP.
Dementsprechend gibt es ein Bedarf für eine Technologie, die zuverlässig und schnell Qa-1 Epitope in einem Protein analysieren kann. In diesem Zusammenhang wurde eine begrenzte Anzahl von biologisch wichtigen Epitope Qa-1 beschrieben. Die meisten dieser QS-1-Epitope wurden während des Studiums der CD8 serendipitously identifiziert+ T Zelle Antworten auf Bakterien13, einen Mangel an TAP3Zellen und Zellen einen Mangel an ERAAP4Zellen, die dazu führen, EAE6dass, 9. Daher ist eine hoher Durchsatz-Technik für die Identifizierung von biologisch wichtigen QS-1-Epitopen in einem definierten Protein wünschenswert. Im folgenden beschreiben wir eine überlappende Peptid (OLP) Bibliothek-Strategie, die funktionale Qa-1 Epitope in einem Protein mit QS-1-Resrticted CD8 Karten+ T-Zell-Linien bestimmten für den OLP-Pool (OLP_pool) eines Proteins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir ein Protokoll für die Analyse von Qa-1 Epitope in einem Protein beschrieben. In Bezug auf dieses Protokoll wurden mehrere andere Strategien auch zuvor gemeldet. Erstens die allogene CD8+ T-Zell-Linien und Klone wurden für die Identifizierung des Qdm1verwendet. Zweitens wurde ein vermeintlicher QS-1-Bindung-Motiv aus der Analyse der Qdm für die Identifizierung von HSP60p216-224 und eine TCRBV8.1 Epitop9,18verwen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für ihre technische Unterstützung und Vorbereitung dieser Handschrift Penelope Garcia. Diese Arbeit wurde durch eine Forschung Innovation Grant (RIG) von der Abteilung für Medizin an der Loma Linda University (681205-2967) und ein pilot Stipendium der National Multiple Sclerosis Society (PP1685), XT unterstützt.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
