Summary

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

Published: December 20, 2017
doi:

Summary

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצה של מולקולות מורכבות 1b histocompatibility הגדולות-קלאסי. חיסון Qa-1-איגוד epitopes הוכח להגדיל ויסות מערכת החיסון רקמות ספציפיות, דהוא במספר מחלות אוטואימוניות. במסמך זה אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד חופפים לצורך זיהוי Qa-1 epitopes של חלבון.

Abstract

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצת 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי מולקולות (MHC-ליברות). נתונים עדכניים מראים כי מולקולות Qa-1 לשחק תפקידים חשובים ב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית, ויסות מערכת החיסון וגורם והגבלת תגובות החיסונית זיהומים וירליים. בנוסף, הגדלת פונקציונלי של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באמצעות epitope התחסנות הראו השפעות טיפוליות במספר מחלות אוטואימוניות בעלי חיים דגמים, למשל ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה, קולגן-induced דלקת מפרקים, סוכרת ולא שמנים. לכן, יש צורך דחוף שיטה ביעילות ובמהירות לזיהוי פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל CD8 Qa-1-מוגבל+ תא T שורות ספציפיות עבור ספריה פפטיד (OLP) חופפים לקביעת Qa-1 epitopes של חלבון. ספריית OLP זו מכילה 15-מר פפטידים חופפים המכסות לכל האורך של חלבון, פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו לאחרונה epitope Qa-1 9-מר בגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (ש א). זה epitope ש א Qa-1 ממופה לאחרונה הוצגה לזירוז CD8 ספציפית epitope, Qa-1-מוגבלת+ T תאים תקנה המערכת החיסונית משופרת הזה ספציפית מיאלין. לכן, פרוטוקול זה שימושי בעתיד לפתוח בחקירה של הרומן יעדים ופונקציות של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים.

Introduction

Qa-1 שייך לקבוצה של 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי (MHC-ליברות) מולקולות בעכברים. Homolog האנושי שלה הוא הלע-אי ראיות קודמות הוכיחה כי מולקולות Qa-1 יש תפקודים ביולוגיים חשובים. ראשית, מולקולות Qa-1 משחק תפקיד חשוב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית. בהקשר זה, Qa-1 מולקולות התפתחו מספר אסטרטגיות כדי לנטר את התיפקוד הרגיל של תא. אסטרטגיה אחת כזו מאפשרת מולקולות Qa-1 ל קומפלקסי טופס עם מנהיג מעובד פפטיד (epitope), כלומר ה-Qa-1 הקובע צירוף (אותה לא ישכחו במהרה) המעובדים של מולקולות MHC-Ia קלאסית רשתית תוך-פלזמית1. אלה של Qa-1/אותה לא ישכחו במהרה מתחמי מאוחר יותר להציג על פני השטח של התא, להיקשר לקולטנים NKG2A מעכבות בתאי NK לעכב NK הורג פעילות2. אם הביטוי של מולקולות MHC-Ia אובד, תא (למשל תא ממאיר) הופך רגיש NK להרוגשניים. האסטרטגיה אחרים מאפשר Qa-1 מולקולות להקים מתחמי Qa-1/epitope חדשים על פני התא בנכונותם ברז (טרנספורטר המשויך עיבוד אנטיגן)3 ו/או ERAAP (aminopeptidase רשתית תוך-פלזמית המשויך עיבוד אנטיגן)4 (שני ליקויים לעיתים קרובות להתרחש בתאים ממאירים). התא המבטאת אלה מתחמי Qa-1/epitope חדש יכול להיות מזוהה ואז חוסל על ידי epitope ספציפיים CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים. שנית, Qa-1 מולקולות זירוז מערכת החיסון תקנה5. בהקשר זה, מתחמי Qa-1/epitope הוכחו לעורר CD8+ הרגולציה ותאי T (Treg) חשובים למניעת נזקי בתיווך החיסון העצמי-רקמות6,7,8 ,9,10. שלישית, CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים הוכחו להגביל את תגובות מערכת החיסון נגד זיהום ויראלי11.

לכן, הגדלת ספציפי של CD8 Qa-1-restrictred epitope ספציפי+ T תאים היא אסטרטגיה פוטנציאל מבטיח עבור חיסול של תאים חריגים, על השיפור של ויסות מערכת החיסון ועל לפקד על המשמעות של תגובות חיסוניות הנוצרות על-ידי וירוס. בזמן זה טרם נקבע אם תוספת ספציפית epitope CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באפשרותך לשפר את המערכת החיסונית מעקב ולהגביל הנוצרות על-ידי וירוס תגובות חיסוניות, מעבדות שלנו ואחרים בבירור הוכיחו את זה חיסון epitopes Qa-1 יכול להגדיל את הפונקציה של CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים ספציפיים עבור פתוגניים CD4 אוטואימוניות+ T תאים, שמוביל שליטה יעילה של CD4+ T תאית מחלות אוטואימוניות ב מגוון רחב של החיות מודלים כגון6,ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה (במודל חיה של טרשת נפוצה אנושי)10, דלקת מפרקים הנגרמת קולגן (במודל חיה של דלקת מפרקים שגרונית אנושי)7, ו סוכרת שאינו שמנים (במודל חיה של האדם סוג 1 סוכרת)8. בנוסף, גילינו כי חיסון epitope Qa-1 רקמות ספציפיות מוביל פקד מסוים של דלקת החיסונית בתיווך תפולס דרך הגדלת של CD8+ Treg תאים12. ההצלחות לעיל של מחקרים פרה להצביע על הערכה מלאה התחסנות epitope Qa-1 לטיפול של רקמות ספציפיות בתיווך החיסונית מחלות ואפשרות עבור הטיפול במחלות אחרות המשויכות ליקויים ברז, ERAAP.

בהתאם לכך, יש ביקוש טכנולוגיה ניתן באמינות ובמהירות לנתח Qa-1 epitopes של חלבון. בהקשר זה, תואר מספר מוגבל של epitopes Qa-1 חשוב מבחינה ביולוגית. רוב epitopes Qa-1 אלה זוהו serendipitously במהלך המחקר של CD8+ T תא התגובות חיידקים13, לקוי ברז3תאים, התאים לקויה ERAAP4ותאים הגורמות EAE6, 9. לכן, טכניקה תפוקה גבוהה רצוי לצורך זיהוי ביולוגית חשובה epitopes Qa-1 בחלבון מוגדר. בחלק זה, אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד (OLP) חופפים הממפה פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון באמצעות CD8 Qa-1-resrticted+ תא T שורות ספציפיות עבור הבריכה OLP (OLP_pool) של חלבון.

Protocol

כל הניסויים נעשו בהתאם, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש בפרוטוקול שאושרו על-ידי חיה אכפת והוועדה שימוש ב אוניברסיטת טקסס El Paso ובאוניברסיטה לומה לינדה. 1. דור של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון עיצוב ספריה OLP שבו כל פפטידים 15-מר אורך הינם פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 …

Representative Results

העיצוב של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון החל קצה אמיני של חלבון, כל פפטיד הוא 15 חומצות אמינו (15-mer). לפיכך, פפטיד הראשון מתפרשת על עמדה 1 לעמדה 15. N-הסופית של פפטיד השני חופף קצה קרבוקסילי של פפטיד הראשון החומצה אמינית 11. לפיכך, פפטיד השני מתפ?…

Discussion

. הנה, תארנו פרוטוקול לניתוח Qa-1 epitopes של חלבון. ביחס פרוטוקול זה, מספר אסטרטגיות אחרות גם דווחו בעבר. ראשית, allogeneic CD8+ תא T קווים שיבוטים שימשו לצורך זיהוי ה1-אותה לא ישכחו במהרה. שנית, מוטיב Qa-1-איגוד בשם מניתוח המצב אותה לא ישכחו במהרה שימש לצורך הזיהוי של HSP60p216-224,9</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים פנלופה גרסיה על הכנת כתב היד הזה וסיוע טכני שלה. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר וחדשנות גרנט (מעטה) מ במחלקה לרפואה באוניברסיטת לומה לינדה (681205-2967), מענק פיילוט מהחברה טרשת הלאומי (PP1685) XT.

Materials

The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

References

  1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
  2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
  3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
  4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
  5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
  6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
  7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
  8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
  9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
  10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
  11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
  12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
  13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
  14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
  15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
  16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
  18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
  19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
  20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
  21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

Play Video

Cite This Article
Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

View Video