Um método geral para detectar a formação de Nitrosamide no metabolismo In Vitro de nitrosaminas por citocromo P450s
Summary
Α-hidroxilação de nitrosaminas cancerígenas pelo citocromo P450s é a aceita via metabólica que produz o DNA de danos intermediários, que causam mutações. No entanto, novos dados indicam mais pode ocorrer oxidação para nitrosamides. Descrevemos um general método para a detecção de nitrosamides produzidos a partir de em vitro citocromo P450-catalisada metabolismo de nitrosaminas.
Abstract
N-nitrosaminas são um grupo bem estabelecido de agentes cancerígenos ambientais, que requerem a oxidação do citocromo P450 que apresentam atividade. O mecanismo aceito de activação metabólica envolve a formação de α-hydroxynitrosamines que decompõem espontaneamente para agentes de alquilação de DNA. Acúmulo de danos ao DNA e mutações resultantes, em última análise, pode levar ao câncer. Novas evidências indicam que α-hydroxynitrosamines pode ser ainda mais oxidado para nitrosamides processively pelo citocromo P450s. Porque nitrosamides são geralmente mais estáveis do que α-hydroxynitrosamines e pode também alquilação de DNA, nitrosamides pode desempenhar um papel na carcinogênese. Neste relatório, descrevemos um protocolo geral para avaliar a produção de nitrosamide em vitro citocromo P450-catalisada do metabolismo de nitrosaminas. Este protocolo utiliza uma abordagem geral para a síntese da nitrosamides relevantes e um em vitro citocromo P450 metabolismo ensaio utilizando espectrometria de massa em tandem de ionização de alta resolução da cromatografia líquida-nanospray para a deteção. Esse método detectado n’– nitrosonorcotinine como um metabólito menor de n– nitrosonornicotine no estudo de exemplo. O método tem alta sensibilidade e deteção de massa seletivamente devida à precisão. Aplicação deste método para uma grande variedade de sistemas de nitrosamina-citocromo P450 ajudará a determinar a generalidade desta transformação. Porque citocromo P450s são polimórficos e variar em atividade, uma melhor compreensão da formação de nitrosamide poderia ajudar na avaliação do risco individual de câncer.
Introduction
N-nitrosaminas são uma grande classe de substâncias cancerígenas encontradas na dieta, produtos do tabaco e o ambiente em geral; Eles também podem ser formados endogenamente no corpo humano1. Mais de 300 N –nitroso compostos foram testados e > 90% foram avaliados como sendo cancerígenos em animais modelos2,3. Para expor sua carcinogenicidade, estes compostos primeiro devem ser ativados pelo citocromo P450s1,2,3. A pesquisa mostra que citocromo P450s oxidar prontamente nitrosaminas para α-hydroxynitrosamines (Figura 1), que são compostos altamente reativos com meia-vida de 5 ~ s antes de decompor-se espontaneamente para alkyldiazohydroxides. Este último pode alkylate DNA após a perda de H2O e N2. O DNA resultante adutos, se sem conserto, pode causar mutações que, em caso de crítica onco – ou genes supressores de tumor, levam ao desenvolvimento de câncer1. Por este motivo, muito esforço tem sido dispendido para adquirir um completo entendimento das vias metabólicas, adutos de DNA e a jusante dos metabolitos de oxidação do citocromo P450 de nitrosaminas cancerígenas. Este conhecimento tem potencial aplicação de avaliação de risco de câncer individual4.
Figura 1: Geral e metabolismo proposto de nitrosaminas.
Nitrosaminas (1) são oxidadas por P450s para α-hydroxynitrosamines (2) que decompõem espontaneamente para alkyldiazohydroxides (3). Estes compostos podem ligar ao DNA para formar que adutos de DNA. Supor que 2 são mais oxidado P450s em nitrosamides 4. Estas diretamente podem vincular a DNA para formar o DNA romance adutos ou ser hidrolisado a 3 para formar que adutos de DNA conhecido. R1 e R2 representam qualquer grupo alquila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Embora a hipótese de α-hydroxynitrosamine é solidamente apoiada por dados abrangentes, existem algumas inconsistências; uma importante é a meia-vida curta de α-hydroxynitrosamines5,6. É conhecido que estes compostos são produzidos na membrana do retículo endoplasmático e posteriormente alquilação de DNA nuclear. Dado seu tempo de vida de alguns segundos, isso é intrigante como esses intermediários sobrevivem a viagem necessária embora o citosol. Uma hipótese é que uma parte da α-hydroxynitrosamines processively são oxidados nitrosamides7,8, que são bastante estáveis na comparação9. Isso provavelmente ocorrerá através de retenção do α-hydroxynitrosamines no sítio activo citocromo P450. Precedente para este tipo de oxidação tem sido visto com nicotina10, álcoois11e simples alkylnitrosamines12,13. Além disso, nitrosamides são agentes cancerígenos de acção directa2,3. Com base em sua reatividade9, estes compostos são acreditados produzir DNA adutos idênticos aos resultantes da α-hydroxynitrosamines, juntamente com o novo, inexplorado DNA adutos (Figura 1). Assim, esta hipótese explica não só o transporte através do citosol, mas também a formação de DNA danificar os produtos.
Neste trabalho, é descrito um protocolo geral para avaliar o em vitro citocromo P450 mediada por conversão de nitrosaminas para nitrosamides. A conversão anteriormente relatada de n– nitrosonornicotine (NNN) para n– nitrosonorcotinine (NNC) pelo citocromo P450 2A6 é mostrada como um exemplo14. Aplicação do presente protocolo para uma ampla gama de sistemas de enzima-substrato ajudará a determinar a importância de nitrosamides no metabolismo de nitrosamina global.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elucidação do metabolismo de nitrosaminas é um componente crítico para a compreensão de sua carcinogenicidade. Desde que os envolvidos citocromo P450s e outras enzimas metabólicas são polimórficas, mais aplicação deste conhecimento potencialmente poderia identificar indivíduos de alto risco1,4. Novos dados indica que mais oxidação do α-hydroxynitrosamines, os presumíveis principais metabolitos de nitrosaminas envolvidos na ligação de DNA, para ni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por grant não. 81301-CA do Instituto Nacional do câncer. Agradecemos a Bob Carlson para assistência editorial, Dr. Peter Villalta Xun Ming para assistência de espectrometria de massa no recurso de compartilhado de bioquímica analítica do centro de câncer maçônico e Dr. Adam T. Zarth e Dr. Anna K. Michel por suas valiosas discussões e de entrada. O recurso de compartilhado de bioquímica analítica parcialmente financiado pela National câncer Instituto câncer centro suporte Grant CA-77598
Materials
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
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