أسلوب العامة للكشف عن تكوين نيتروساميدي في الأيض في المختبر من نيتروسامينيز من الفسفرة P450s
Summary
Α-هيدروكسيليشن نيتروسامينيز المسببة للسرطان من الفسفرة P450s هو مسار الأيض المقبولة التي تنتج المواد الوسيطة تضر بالحمض النووي، التي تتسبب في حدوث طفرات. بيد أن البيانات الجديدة تشير إلى زيادة الأكسدة إلى نيتروساميديس يمكن أن تحدث. يصف لنا عامة الأسلوب للكشف عن نيتروساميديس المنتجة من المختبر السيتوكروم P450 حفزت استقلاب نيتروسامينيز.
Abstract
ن-نيتروسامينيز هي مجموعة راسخة من المسرطنات البيئية، التي تقتضي أكسدة السيتوكروم P450 معرض النشاط. إليه مقبولة للتنشيط الأيضي ينطوي على تشكيل α-هيدروكسينيتروسامينيس التي تتحلل تلقائياً إلى وكلاء alkylating الحمض النووي. تراكم الأضرار الحمض النووي والطفرات الناتجة يمكن أن تؤدي في النهاية إلى مرض السرطان. أدلة جديدة تشير إلى أن α-هيدروكسينيتروسامينيس يمكن أن يكون كذلك تتأكسد إلى نيتروساميديس بروسيسيفيلي من الفسفرة P450s. نيتروساميديس لأن نيتروساميديس هي عموما أكثر استقرارا من α-هيدروكسينيتروسامينيس، ويمكن أيضا الكيلات الحمض النووي، قد تلعب دوراً في التسرطن. في هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول عام لتقييم إنتاج نيتروساميدي من المختبر السيتوكروم P450 حفز الأيض نيتروسامينيز. هذا البروتوكول يستخدم نهج عام لتركيب نيتروساميديس ذات الصلة و في المختبر السيتوكروم P450 أيض مقايسة باستخدام نانوسبراي كروماتوغرافيا سائلة عالية التأين القرار جنبا إلى جنب الكتلي للكشف. هذا الأسلوب الكشف عن N′-نيتروسونوركوتينيني ك المستقلب طفيفة من N′-نيتروسونورنيكوتيني في دراسة المثال. يحتوي الأسلوب على حساسية عالية، والواجب بشكل انتقائي لدقة الكشف الشامل. تطبيق هذا الأسلوب على مجموعة متنوعة من نظم النيتروسامين-السيتوكروم P450 سيساعد في تحديد الطابع العام لهذا التحول. لأن الفسفرة P450s متعددة الأشكال وتختلف في النشاط، فهم أفضل لتشكيل نيتروساميدي يمكن أن تساعد في تقييم مخاطر السرطان الفردية.
Introduction
ن-نيتروسامينيز فئة كبيرة من المواد المسرطنة الموجودة في النظام الغذائي ومنتجات التبغ، والبيئة العامة؛ أنها يمكن أيضا أن تشكل اندوجينوسلي في جسم الإنسان1. واختبرت أكثر من 300 ن-مركبات نيتروزو و > 90% قيمت المسرطنة كما في النماذج الحيوانية2،3. يحمل على السرطنة، يجب أولاً تنشيط هذه المركبات من الفسفرة P450s1،،من23. وتبين البحوث أن الفسفرة P450s سهولة أكسدة نيتروسامينيز إلى α-هيدروكسينيتروسامينيس (الشكل 1)، ومركبات شديدة التفاعل مع إنصاف ~ 5 s قبل المتحللة تلقائياً إلى الكيلديازوهيدروكسيديس. يمكن الكيلات الأخير الحمض النووي بعد فقدان ح2س ون2. الناتجة عن ذلك الحمض النووي adducts، إذا سوائلها، يمكن أن يسبب الطفرات التي، إذا أونكو الحرجة-أو ورم المكثف الجينات، تؤدي إلى السرطان التنمية1. لهذا السبب، فقد أنفق الكثير من الجهد للحصول على فهم كامل للمسارات الأيضية، والحمض النووي adducts، والمتلقين للمعلومات من أكسدة السيتوكروم P450 نيتروسامينيز المسببة للسرطان. هذه المعرفة بإمكانية تطبيقها في تقييم مخاطر السرطان الفردية4.
الشكل 1: العامة والتمثيل الغذائي المقترح من نيتروسامينيز.
تتأكسد نيتروسامينيز (1) من P450s إلى α-هيدروكسينيتروسامينيس (2) التي تتحلل تلقائياً إلى الكيلديازوهيدروكسيديس (3). يمكن ربط هذه المركبات للحمض النووي لتشكيل الحمض النووي adducts. هو الافتراض بأن 2 تتأكسد المزيد من P450s إلى نيتروساميديس 4. هذه مباشرة ربط الحمض النووي بشكل رواية الحمض النووي adducts أو أن تحلل إلى 3 لنموذج معروف الحمض النووي adducts. ص1 وص2 تمثل أي مجموعة الألكيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
على الرغم من أن الفرضية α-هيدروكسينيتروساميني قوة تدعمها البيانات واسعة النطاق، هناك بعض أوجه عدم الاتساق؛ رئيسي هو أن نصف العمر القصير α-هيدروكسينيتروسامينيس5،6. ومن المعروف أن هذه المركبات تنتج في غشاء هيولى وفي وقت لاحق الكيلاتي الحمض النووي. نظراً لحياتها لبضع ثوان، مما يبعث على الحيرة كيف هذه الوسيطة البقاء على قيد الحياة السفر المطلوبة على الرغم من سيتوسول. فرضية واحدة أن قسما من α-هيدروكسينيتروسامينيس تتأكسد بروسيسيفيلي نيتروساميديس،من78، التي هي مستقر تماما في المقارنة بين9. سوف يفترض أن يحدث هذا عن طريق الاحتفاظ α-هيدروكسينيتروسامينيس في موقع نشط السيتوكروم P450. وقد شوهد سابقة لهذا النوع من الأكسدة مع النيكوتين10، كحول11و12،الكيلنيتروسامينيس بسيطة13. بالإضافة إلى ذلك، يتم نيتروساميديس المباشر المسرطنة2،3. استناداً إلى ما مفاعليه9، يعتقد هذه المركبات لإنتاج الحمض النووي adducts مماثلة لتلك الناتجة عن α-هيدروكسينيتروسامينيس إلى جانب جديد، غير مستكشفة الحمض النووي adducts (الشكل 1). وبالتالي، يفسر هذا الافتراض ليس فقط النقل عن طريق سيتوسول، ولكن أيضا تشكيل الحمض النووي إلى تلف المنتجات.
ويرد في هذه الورقة، وبروتوكول عام لتقييم في المختبر السيتوكروم P450 بوساطة تحويل نيتروسامينيز إلى نيتروساميديس. وعرضت تحويل المبلغ عنها سابقا N′-نيتروسونورنيكوتيني (NNN) إلى N′-نيتروسونوركوتينيني (مركز التغذية الوطني) من 2A6 السيتوكروم P450 ك مثال14. تطبيق هذا البروتوكول على طائفة واسعة من نظم إنزيم الركازة سيساعد في تحديد أهمية نيتروساميديس في العام النيتروسامين الأيض.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضيح استقلاب نيتروسامينيز عنصر حاسم للتفاهم على السرطنة. منذ الفسفرة المعنية P450s والأنزيمات الاستقلابية الأخرى متعددة الأشكال، مواصلة تحديد تطبيق هذه المعارف عالية المخاطر الأفراد1،4يمكن أن يحتمل. البيانات الجديدة تشير إلى أن زيادة أكسدة α-هيدروكسينيتر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة كانت تدعمها منحة لا. كاليفورنيا–81301 من معهد السرطان الوطني. ونحن نشكر بوب كارلسون للمساعدة التحريرية، الدكتور بيتر فيﻻلتا وشون مينغ للمساعدة الكتلي في “الموارد المشتركة الكيمياء الحيوية التحليلية” لمركز السرطان الماسونية، والدكتور آدم ت. زارث والدكتور ميشال ك. أنا لمناقشاتهم قيمة والمدخلات. الموارد المشتركة في الكيمياء التحليلية معتمد جزئيا من الوطنية سرطان معهد السرطان مركز دعم منحة CA-77598
Materials
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
- Rom, W. N., Markowitz, S. . Environmental and Occupational Medicine. , 1226-1239 (2007).
- Preussmann, R., Stewart, B. W., Searle, C. E. . Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. 2, 643-828 (1984).
- Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R., Searle, C. E. . Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. , 491-625 (1976).
- Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
- Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
- Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
- Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
- Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
- Chow, Y. L. . ACS Symposium Series. 101, 13-37 (1979).
- von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5′(1′)iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
- Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
- Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
- Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
- Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
- Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
- van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
- White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
- Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N’-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
- Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N’-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
- Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
- von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).
