Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.
N-nitrosaminen zijn een gevestigde groep van milieu kankerverwekkende stoffen, waarvoor cytochroom P450 oxidatie activiteit vertonen. De aanvaarde mechanisme van metabole activering omvat vorming van α-hydroxynitrosamines die spontaan aan DNA alkylerend agentia ontleden. Accumulatie van DNA-beschadiging en de resulterende mutaties kan uiteindelijk leiden tot kanker. Nieuw bewijs geeft aan dat α-hydroxynitrosamines kan worden verder geoxideerd tot nitrosamides processively door cytochroom P450s. Omdat nitrosamides over het algemeen stabieler dan α-hydroxynitrosamines zijn en kan ook DNA alkylate, kan nitrosamides een rol spelen in carcinogenese. In dit verslag beschrijven we een algemeen protocol voor de evaluatie van de nitrosamide productie van in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen. Dit protocol maakt gebruik van een algemene aanpak van de synthese van de relevante nitrosamides en een in vitro cytochroom P450 metabolisme bepaling met behulp van vloeibare chromatografie-nanospray ionisatie-hoge resolutie tandem massaspectrometrie voor de detectie. Deze methode ontdekt N′– nitrosonorcotinine als een minder belangrijke metaboliet van N′– nitrosonornicotine in de voorbeeld-studie. De methode heeft hoge gevoeligheid en selectief moeten nauwkeurige detectie van de massa. Toepassing van deze methode op een breed scala aan nitrosamine-cytochroom P450 systemen zal medebepalend zijn voor de algemene strekking van deze transformatie. Omdat cytochroom P450s polymorf zijn en in activiteit variëren, zou een beter begrip van de vorming van de nitrosamide helpen bij het individuele kanker risico-evaluatie.
N-nitrosaminen vormen een grote klasse van kankerverwekkende stoffen gevonden in het dieet, tabaksproducten en het algemene klimaat; ze kunnen ook endogeen worden gevormd in het menselijk lichaam1. Meer dan 300 N –nitroso verbindingen zijn getest en > 90% werden geëvalueerd als kankerverwekkend in diermodellen2,3. Om te exposeren hun carcinogeniteit, moeten deze verbindingen eerst worden geactiveerd door cytochroom P450s1,2,3. Onderzoek toont aan dat cytochroom P450s gemakkelijk oxideren nitrosaminen naar α-hydroxynitrosamines (Figuur 1), die zeer reactieve verbindingen met half-leven van ~ 5 zijn s voordat spontaan ontbindend te alkyldiazohydroxides. De laatste kan DNA na het verlies van H2O en N2alkylate. De resulterende DNA adducten, als herstelde, mutaties, die als kritische onco- of tumor suppressor genen, tot kanker ontwikkeling1 leidenkunnen veroorzaken. Om deze reden veel moeite heeft zijn uitgegeven om het verwerven van een volledig begrip van de metabole routes, DNA adducten, en stroomafwaarts metabolieten van cytochroom P450 oxidatie van kankerverwekkende nitrosaminen. Deze kennis heeft potentiële toepassing in individuele kanker risico beoordeling4.
Figuur 1: Algemeen en voorgestelde metabolisme van nitrosaminen.
Nitrosaminen (1) zijn geoxideerd door P450s tot α-hydroxynitrosamines (2) die spontaan tot alkyldiazohydroxides (3 ontleden). Deze verbindingen kunnen binden aan DNA aan formulier die DNA adducten. Het is veronderstelde dat 2 zijn verder geoxideerd door P450s tot nitrosamides 4. Deze kunnen direct binden aan DNA aan formulier nieuwe DNA adducten of worden gehydrolyseerd tot 3 aan formulier die bekende DNA adducten. R1 en R2 vertegenwoordigen een alkyl-groep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Hoewel de α-hydroxynitrosamine hypothese is stevig ondersteund door uitgebreide gegevens, zijn er enkele tegenstrijdigheden; een groot probleem is de korte halfwaardetijd van α-hydroxynitrosamines5,6. Het is bekend dat deze stoffen worden geproduceerd op het membraan van het endoplasmatisch reticulum en later nucleaire DNA alkylate. Gezien hun leven voor een paar seconden, is het puzzelen hoe deze tussenproducten overleven de vereiste reizen al het cytosol. Een hypothese is dat een deel van de α-hydroxynitrosamines processively zijn geoxideerd tot nitrosamides7,8, die zijn vrij stabiel in vergelijking9. Dit gebeurt vermoedelijk via retentie van α-hydroxynitrosamines in de cytochroom P450 actieve site. Precedent voor dit soort oxidatie gesignaleerd met nicotine10, alcoholen11en eenvoudige alkylnitrosamines12,13. Daarnaast zijn de nitrosamides direct-acting kankerverwekkende stoffen2,3. Op basis van hun reactiviteit9, worden deze verbindingen verondersteld tot DNA adducten identiek zijn aan die welke voortvloeien uit α-hydroxynitrosamines samen met nieuw, onontgonnen DNA adducten (Figuur 1). Dus deze hypothese verklaart niet alleen het vervoer via het cytosol, maar ook de vorming van DNA schade aan producten.
In deze paper wordt een algemeen protocol voor de beoordeling van het in vitro cytochroom P450-gemedieerde conversie van nitrosaminen naar nitrosamides beschreven. De eerder gerapporteerde conversie van N′– nitrosonornicotine (NNN) naar N′– nitrosonorcotinine (NNC) door cytochroom P450 2A6 is tentoongesteld als een voorbeeld14. Toepassing van dit protocol tot een brede waaier van substraat-enzym systemen zal medebepalend zijn voor het belang van nitrosamides in algemene nitrosamine metabolisme.
Ophelderen van het metabolisme van nitrosaminen is een essentieel onderdeel voor het begrip van hun carcinogeniteit. Aangezien de betrokken cytochroom P450s en andere metabole enzymen polymorf zijn, verder is toepassing van deze kennis kon potentieel identificeren hoog risico personen1,4. Nieuwe data geeft aan dat verdere oxidatie van α-hydroxynitrosamines, de vermoedelijke belangrijkste metabolieten van nitrosaminen betrokken in het DNA binden, nitrosamides is …
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door de subsidie geen. CA-81301 van het National Cancer Institute. Wij danken Bob Carlson voor redactionele ondersteuning, Dr. Peter Villalta en Xun Ming voor de bijstandsverlening van de Spectrometrie van de massa in de analytische biochemie gedeelde Resource van de vrijmetselaars Cancer Center, en Dr. Adam T. Zarth en Dr. Anna K. Michel voor hun waardevolle discussies en input. De analytische biochemie gedeelde Resource wordt gedeeltelijk ondersteund door nationaal kanker instituut Cancer Center ondersteuning Grant CA-77598
Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |