이 기술은 작은 분자 화학의 급속 한 식별에 대 한 fibered 공초점 형광 현미경 검사 법에 의해 인간의 폐 조직, ex vivo에서 박테리아 특정 광학 이미징 에이전트를 평가 하기 위한 효율적인 심사 과정을 설명 합니다. 프로브-번역 잠재력 후보자입니다.
속도 세균 검색의 정확도 개선 환자 계층에 대 한 항균의 적절 한 사용을 보장 하기 위해 중요 하다. 세균의 존재를 인식 하는 진단 기술의 개발이이 목표를 달성 하기에 포인트의 케어에 실시간으로 필요. 광학 이미징 호스트 내에서 박테리아의 직접 식별에 대 한 매력입니다. 그러나 화학 프로브 설계 및 검증에 몇몇 시도, 아무도 아직 성공적으로 번역 된 병원으로 조사 했습니다. 여기는 박테리아 관련 프로브 fibered 공초점 형광 현미경 검사 법 (FCFM)에 의해 몇 군데 말 초 폐 내의 박테리아의 식별에 대 한 유효성 검사 비보 전 하는 방법에 설명 합니다. 우리의 모델 인간의 폐 조직 비보 전 화면 소설 박테리아 특정 화합물, 밀접 하 게 환자와 발생 될 것으로 예상 하는 이미징 조건을 흉내 낸 영상에 임상 승인된 confocal 레이저 endomicroscopy (CLE) 플랫폼을 사용. 따라서,이 기술에 의해 화합물 심사 잠재적인 임상 추적성의 신뢰를 제공 합니다.
이 기술은 CLE 시각화에 대 한 잠재적인 임상 유틸리티와 화합물의 급속 한 식별을 위해 FCFM를 사용 하 여 인간의 폐 조직에 ex vivo에서 박테리아 특정 광학 이미징 에이전트를 평가 하기 위한 신속한 심사 과정을 설명 합니다. 말 초 폐 제자리에 박테리아.
항균 처방 상승 항균 성 저항1의 시대에서 배급 하는 긴급 한 글로벌 요구 사항이입니다. 이 위해, 높은 특이성, 감도, 그리고 실시간으로 세균 감염을 식별 하는 법은 매우 진단 방법의 개발 모색2. 비판적으로 몸이 환자 집중 치료 단위 (ICUs) 내 등에서 폐 렴의 진단을 확인 하는 현재 기술 자주 세균성 문화 기술 함께 일반적인 임상 또는 생체 기능 해석에 의존 aspirated 체액/조직, 결과가 최대 3 일 걸릴 수 있습니다. 또한, 액체에서 세균성 문화 말 초 폐로 얻은 고 검색 더 인접 항공3 의 오염 경향이 종종 문화 부정적 이다 수 반하는 항균 치료 또는 가난한 샘플링 기법. 또한, 연쇄 반응 같은 분자 기술을 지나치게 민감한 환자의 스팟은 걸고 aspirated 체액에 사용 될 때 있습니다. 신흥 진단 접근은 분자 광학 이미징, 제작 현장에서 분자 병 리 조직의 가능성; 그러나, 개발 및 광학 이미징 화합물의 유효성 검사가 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, 직접 시각화 가능한 광학 프로브를 통해 박테리아의 잠재적으로 존재의 연구를 허용 하는 매우 강력한 방법 이며 폐 렴의 진화 환자, 그리고 중요 한, 사용 될 수 있는 호스트 병원 체 상호 작용을 공부 하 실시간으로 치료에 대 한 응답 현장에서.
CLE은 여러 질병4, 필드 내에서 위장5, 종양학6,7, 그리고 심문 기도 및 치조 낭8, 등 설립된 조사 절차 9. 포인트의 케어 구조 영상 이미징 번들, 임상 내 시경의 작업 채널을 통해 전달 하는 섬유를 사용 하 여 병에 걸리는 직물의 수와 형태 직접 조직 표면 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지를 접촉. 그러나 한계가 남아 있는 일반적인 조 영제에 대 한 필요는. 따라서, 특정 세균 에이전트 같은 질병 특정 프로브를 사용 하 여 직접 의심된 감염의 사이트에 박테리아를 시각화 하 여이 양식 적임의 유틸리티를 확장 크게 수 있습니다. 광학 에이전트 실시간 고해상도 이미징 진단 가능성을 함으로써 다른 기술에 비해 많은 장점이 제공 합니다. 또한, 광학 프로브 여러 대상, 모두 상대적으로 저렴 한 비용 달성된을 질문에 대 한 다중화의 전망 제공. 그러나 아무도 아직 성공적으로 구현 클리닉10광학 에이전트 수가 이러한 목적에 대 한 개발을 받고 있다. 우리 쪽으로 박테리아도 작은 분자 화학 감지기의 라이브러리를 합성 하 고 제자리에서세균성 폐 렴11을 탐지 하기 위한 프로브 함수의 평가 대 한 신속 하 고 효과적인 파이프라인을 개발.
적합 한 프로브 후보를 식별 하려면 다음 필수 구성 요소 FCFM에 의해 비보 전 인간의 폐 조직에 조사의 심문 전에 실현 될 했다: i) 수성 가용성, ii) 특이성 및 급속 하 게 임상적으로 라벨에 대 한 선택 관련 박테리아, iii) 높은 신호 대 잡음 비율, 및 iv) 폐 환경 강 직에 저항. 후자는 평가 bronchoalveolar 게 액체 (BALF)에 의해 급성 호흡 곤란 증후군 (아즈) 환자에서 조건 중 환자 실에 폐에서 분해 하 고 자극적인 환경에 의해 특징입니다. 또한, 프로브 탐지 장치에 의해 임상 승인 광학 CLE 이미징 인간의 폐 치조 조직 내에서 대 한 적합 한 fluorophore를 했다.
가 각의 이러한 필수 구성이 요소는 파이프라인은 다음과 같습니다 (각 단계에서 전달 된 프로브만 실시 했다 앞으로 다음): (1) 조사를 프로브 라이브러리 합성 되었다; (2) 각 프로브 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM) 세균성 라벨; 되도록에 대 한 라이브 박테리아의 패널에 추가 되었습니다. (3) 공동 문화 기본 인간 호 중구에서에서 포유류 세포에 세균 라벨의 선택도 CLSM;에 의해 설립 되었다 (4) 안정성과 아즈 환자 BALF 존재 박테리아의 성공적인 라벨 CLSM과 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석;에 의해 결정 되었다 (5) 최적 농도 후보자의 CLSM, 포유류 세포에 박테리아를 유지 했다;에 대 한 선택도 보장에 의해 결정 되었다 (6) 후보에에서 FCFM에 의해 몇 군데 있었다 고 비보 전 인간의 폐 치조 조직 안정성과 그를 위해에 신호–소음 감지에 대 한 적절 한 했다. 단계 6이이 프로토콜 내에서 자세히 설명 되어 있습니다. 1-5 단계에 대 한 방법론은 이전에 보고 된11이었다.
두 번째를 담당으로 하는 더 낮은 호흡 기관 감염 질병의 높은 부담 세계적으로12,13, 그리고 상당한 상승에 수 항균 방지 박테리아에 기인 하는 감염 되었습니다 보고14. 폐 렴 입원에 대 한 일반적인 원인은 남아 있다. 중 환자 실, 폐 염의 개발 진단 불확실성에 의해 혼합 이며 매우 높은 사망률 속도15와 연결 됩니다. 폐 렴의 발병 기간 동안 박테리아 증식 치경의 공간 내에 원심 폐 건강에 최소한의 microbiota와 상대적으로 무 균 지역.
상대적으로 늦게 단계 비보 전 유효성 검사 박테리아-특정 광학 이미징 프로브11, 하지만 설계, 합성,이 방법에 설명 합니다 및이 유효성 검사 단계를 시작 하기 전에 조사 평가 필수적으로 이전 표시11 .
CLE 질병 질문에 대 한 새로운 임상 기술을 현장에서 실시간으로 상태 이다. 그것은 많은 이점이 의심된 폐 병 리, 생 검 및 게 액체의 컬렉션을 포함 수 있습니다 조사를 위한 전통적인 기술 제공 합니다. Biopsies 침략은 통풍된 환자에서 사망률 및 사망을 일으킬 수 있습니다 그리고 수집된 게 액체는 종종 위 항공에서 박테리아와 오염. 그러나 폐 렴의 검출에 CLE의 사용은 다소 호환 이미징의 빈약한 가용성으로 인해 제한 된 프로브는 많은 공동된 노력10에 불구 하 고 질병의 기능 정보를 제공할 수 있습니다. 빨리 폐 렴을 진단의 전망 제공 CLE 광학 에이전트와 결합 하 고 덜 접촉 현재 표준 연습에 비해.
이 프로토콜에 중요 한 단계는 샘플 준비와 CLE 플랫폼의 설치에 있습니다. 인체 조직 관련 최종 임상 응용 프로그램 얻기도이 연구에서와 같이 인간의 폐 조직 같은 중요 하다. 그것은 인간의 조직 조직 autofluorescence의 범위 큰 간 종 변화를 표시 하 고 따라서 몇 군데 되 고 박테리아 프로브의 감도 오해 수 있습니다 때문에 사용 해야 합니다. 또한, 검색 및 인간의 폐 조직의 사용에 대 한 윤리를 얻는 것은 필수입니다. 기술 수준, 올바른 청소에서 이미징 LSU 플랫폼, 및 교정에 이미징 섬유의 부착 박테리아의 동등한 숫자 각 폐 조직 샘플에 추가 보장은 좋은 해상도 일관 된 이미지에 대 한 필수적입니다. 프로브 패널 심사에 대 한이 메서드의 유틸리티 확대, 다양 한 병원 균, 폐 렴의 원인이 되는 에이전트 될 것 같은 절차를 반복 하는 필요 합니다.
이 기술의 가장 큰 한계는 임상 승인된 CLE 장치는 단 하나의 레이저 (488 nm). 따라서, 현재, 프로브 디자인 fluorophore의 선택 제한 됩니다이 시스템 사용에 대 한 임상 승인 단색 여기 파장 660 nm의 근 적외선 장치 존재 하지만. 그것은 매우 바람직한 박테리아 프로브 감도 조직 autofluorescence의 수준 향상에 괴기 하 게 뚜렷한 fluorophore와 개발 프로브를 사용 하려면 동일한 장치 내에서 구현 하는 두 번째 레이저 라인을가지고. 듀얼 컬러 CLE 장치를 개발 하는 동안 하지 임상 승인 하거나 또는 그들의 비용이 상당한16이다.
CLE에서 생체 외에서 병원 성 박테리아 및 비보 전 인간의 폐 조직 화면 잠재적인 프로브를 사용 하 여 기존의 생체 외에서 기술이 cytometry CLSM, 및 임상 유틸리티 간의 격차 다리. 이 단계 제공 자신감 앞으로 임상 CLE와 결합을 수행 하기 위해 유망한 화합물을 선택할 때 이미징; 그리고 표시 여부 테스트 조사 대상 특이성을 유지 또는 어떤 대상 오프 라벨, 조직에 직접 바인딩 같은 보여 줍니다 또는 쇼 호스트와 불안정 분해 효소를 제공할 것입니다. 그것은 또한 인간의 폐 조직 플러스 완전히 프로브 바인딩 및 실시간으로 활성화의 속도 특성 박테리아의 샘플을 직접 각 가능한 프로브를 추가 하는 타당 한 것입니다.
우리는 빠르게 환자의 말 초 폐 내 이미징에 대 한 그들의 잠재력을 평가 하기 위해 새로운 박테리아 관련 프로브 심사에 대 한 우리의 파이프라인 병원에 훨씬 더 빨리 번역 될 것을 믿습니다. 이것은 주로 박테리아 관련 프로브 그 microdose을 의미 하는 bronchoscope의 작업 채널 아래로 삽입 카 테 터를 통해 폐 내에서 로컬로 배달 될 수 있기 때문에 (< 100 µ g) 금액 전달 될 수 있습니다. 따라서, 조직의 배달 및 화합물의 biodistribution 아니다 관심사, 신체 내에서, 또는 핵 영상과 다른 많은 감염 대상에 대 한 경우입니다. 또한, 독성의 위험을 감소 같은 작은 복용량에서 이미징 프로브를 제공 (비록 독성 심사 번역에 필요한 것) 합병증을 관련. 탐사선의 문제, 다음 테 다음 FCFM 섬유 및 심문 CLE, 거의 같은 방식으로 우리가이 메서드 내에서 수행 하는 폐의 같은 지역에 의해 대체 될 수 있습니다. 이미징은 프로브 탐지 농도를 멀리 세척 하기 전에 빠르게 프로브 설치에 따라 수행 되어야 한다.
그것은 또한 질병을 식별의 그 심사 주의 하는 것이 중요이 기술에 의해 프로브 박테리아 이미징 에이전트에 국한 되어서는 안 하지만 염증 같은 다른 목표와 프로브의 유효성 검사를 또한 확장할 수. 이 방법은 또한 신체 내에서 FCFM 통해 상상 허용 하는 다른 질병 위치에 적응할 수 있어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 공학 및 물리 과학 연구 위원회 (EPSRC, 영국) 학 제 공동 연구 그랜트 EP/K03197X/1, 보건 및 Wellcome 신망 건강 혁신 도전 기금 (HICF)을 통해 감사 하 고 싶습니다. . 자금 참조 번호: 0510-069입니다.
1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |