Questa tecnica viene descritto un processo di screening efficace per la valutazione dei batteri specifici agenti imaging ottici all’interno di ex vivo tessuto polmonare umano, mediante microscopia a fluorescenza confocale fibrata per la rapida identificazione di piccola molecola chimica sonda-candidati con potenziale traducibili.
Migliorando la velocità e la precisione del rilevamento batterica è importante per la stratificazione del paziente e per garantire l’uso appropriato degli antimicrobici. Per raggiungere questo obiettivo, lo sviluppo di tecniche diagnostiche di riconoscere la presenza batterica in tempo reale presso il punto-di-cura è necessaria. Imaging ottico per identificazione diretta di batteri all’interno dell’host è un approccio attraente. Parecchi tentativi di sonda chimica progettazione e validazione sono stati studiati, tuttavia nessuno sono ancora correttamente tradotte in clinica. Qui descriviamo un metodo per la convalida ex vivo di sonde di batteri specifici per l’identificazione dei batteri all’interno del polmone distale, ripreso da microscopia di fluorescenza confocale fibered (FCFM). Il nostro modello utilizzato ex vivo tessuto polmonare umano e una piattaforma di endomicroscopia (CLE) laser confocale clinicamente approvata al romanzo schermo batteri specifici composti, che imita molto attentamente imaging condizioni dovute essere verificato con i pazienti di imaging. Pertanto, lo screening di composti da questa tecnica fornisce fiducia del potenziale clinico trattabilità.
Questa tecnica viene descritto un processo di screening rapido per la valutazione dei batteri specifici agenti imaging ottici all’interno di ex vivo tessuto polmonare umano di CLE utilizza FCFM per la rapida identificazione di composti con potenziale utilità clinica per la visualizzazione batteri nel polmone distale in situ.
C’è un’urgente necessità globale di razione prescrizione antimicrobica nell’era della crescente resistenza agli antimicrobici1. A tal fine, lo sviluppo di metodi diagnostici che agiscono per identificare l’infezione batterica con alta specificità, sensibilità e in tempo reale sono altamente cercato2. Tecniche correnti per confermare una diagnosi di polmonite in pazienti criticamente malati, come quelli all’interno di unità di terapia intensiva (ICUs), spesso si basano sull’interpretazione non specifiche caratteristiche cliniche o radiologiche insieme a tecniche di coltura batterica da aspirato fluidi/tessuti, che può durare fino a 3 giorni per produrre risultati. Inoltre, coltura batterica dal liquido instillato nel polmone distale ed estratto è soggetto a contaminazione da più prossimale airways3 e spesso è cultura negativa a causa di concomitante terapia antimicrobica o tecniche di campionamento poveri. Inoltre, le tecniche molecolari come reazione a catena della polimerasi sono eccessivamente sensibili quando viene utilizzato su liquidi aspirati, rischiando di overtreatment di pazienti. Un approccio diagnostico emergente è molecular imaging ottico, rendendo in situ patologia molecolare dei tessuti una possibilità; Tuttavia, lo sviluppo e la convalida dei composti di imaging ottici è necessaria. Tuttavia, la visualizzazione diretta dei batteri, tramite sonde ottiche attivabile è potenzialmente un metodo molto potente per permettere lo studio della presenza ed evoluzione di polmonite nel paziente e soprattutto, potrebbe essere utilizzato per studiare le interazioni ospite-patogeno in risposta alle terapie in tempo reale in situ.
CLE è una procedura ormai investigativa in molteplici malattie4, compresi all’interno dei campi di gastroenterologia5, oncologia6,7e per interrogare airways e sacche alveolari8, 9. esso permette l’imaging strutturale a point-of-care del tessuto malato usando una fibra in bundle, che passa attraverso il canale operativo di un endoscopio clinico di imaging e forme diretto contatto con la superficie del tessuto siano imaged mediante microscopia confocale. Tuttavia, una limitazione che rimane è la necessità di agenti di contrasto generico. Pertanto, l’uso di sonde specifiche di malattia, quali agenti batterici specifici, potrebbe espandere notevolmente l’utilità di questa modalità visualizzando direttamente i batteri nel sito di sospetta infezione. Agenti ottici offrono molti vantaggi rispetto ad altre tecniche, consentendo la formazione immagine ad alta risoluzione in tempo reale con potenziale diagnostico. Inoltre, sonde ottiche offrono la prospettiva di multiplexing per interrogare i bersagli multipli, tutti raggiunti ad un costo relativamente basso. Un numero di agenti ottici è in fase di sviluppo per tale scopo, tuttavia non sono ancora state attuate con successo entro la clinica10. Abbiamo sintetizzato una libreria di sonde chimiche piccola molecola con specificità verso batteri e sviluppato una pipeline di rapida ed efficace per la valutazione della funzione di sonda per il rilevamento di polmonite batterica in situ11.
Per identificare i candidati idonei sonda, i seguenti prerequisiti dovevano essere compiute prima dell’interrogatorio della sonda su ex vivo tessuto polmonare umano di FCFM: i) acquoso solubilità, ii) specificità e selettività per l’etichettatura rapida clinicamente i batteri rilevanti, iii) un alto rapporto segnale-rumore e iv) resistenza alla degradazione all’interno dell’ambiente del polmone. Quest’ultima è stata valutata dal fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF) dai pazienti con sindrome da distress respiratorio (ARDS), che è una condizione che è caratterizzata da ambienti proteolitici e infiammatori nel polmone in terapia intensiva. Inoltre, le sonde doveva avere un fluoroforo adatto per il rilevamento di un dispositivo clinicamente approvato di CLE imaging ottico all’interno del tessuto alveolare del polmone umano.
La pipeline per interrogare ognuno di questi prerequisiti è stato come segue (in ogni fase, solo le sonde che passati sono state riportate al successivo): (1) una libreria di sonde per essere indagato è stata sintetizzata; (2) ogni sonda è stato aggiunto a un pannello di batteri vivi per laser confocale microscopia (CLSM) per assicurare l’etichettatura batterica; (3) selettività di etichettatura batterica sopra cellule di mammifero in co-colture con neutrofili umani primari è stato stabilito da CLSM; (4) stabilità e successo etichettatura dei batteri in presenza del paziente ARDS BALF è stata determinata da CLSM e Matrix Assisted Laser desorbimento/ionizzazione-tempo di spettrometria di massa (MALDI-TOF) di volo; (5) concentrazione ottimale dei candidati è stata determinata da CLSM, garantire la selettività per batteri sopra cellule di mammiferi è stata mantenuta; (6) i candidati erano imaged di FCFM in sospensione e su ex vivo del polmone umano tessuto alveolare per assicurare stabilità e che il segnale-rumore era adeguato per il rilevamento. Passaggio 6 è descritto in dettaglio all’interno di questo protocollo. Metodologia per passaggi 1-5 è stato precedentemente segnalati11.
Infezioni del tratto respiratorio inferiore rappresentano il secondo più alto carico di malattia a livello globale12,13e un sostanziale aumento il numero delle infezioni attribuite ai batteri resistenti agli antimicrobici è stato segnalato14. Polmonite rimane una causa comune di ospedalizzazione. In terapia intensiva, lo sviluppo di una polmonite è aggravato dalla incertezza diagnostica ed è associato con un tasso di mortalità estremamente alta15. Durante l’insorgenza di polmonite, i batteri proliferano all’interno dello spazio alveolare del polmone distale, un’area che è relativamente sterile, con minima microbiota in salute.
Questo metodo viene descritto relativamente tarda fase ex vivo convalida di batteri specifici optical imaging sonde11, ma la progettazione, sintesi e valutazione di sonda prima di iniziare questo passaggio di convalida è imperativo, come illustrato in precedenza11 .
CLE è una tecnica clinica emergente per interrogare la malattia dichiara in situ in tempo reale. Offre molti vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali di indagine sospetta patologia polmonare, che può comportare una biopsia e una raccolta di fluido di lavaggio. Le biopsie sono invasive e possono causare la morbosità e la mortalità in pazienti arieggiati e fluido di lavaggio raccolti è spesso contaminato con batteri dalle vie aeree superiori. L’uso di CLE nella rilevazione di polmonite è tuttavia piuttosto limitata a causa della scarsa disponibilità di imaging compatibile sonde che possono fornire informazioni funzionali della malattia, nonostante molti sforzi concertati10. Combinando la CLE con agenti ottici offre la prospettiva di diagnosi di polmonite più veloce e meno invasivo rispetto alla corrente pratica standard.
I passaggi critici per questo protocollo sono nella preparazione del campione e l’installazione della piattaforma CLE. Ottenimento di tessuti umani rilevanti per l’applicazione clinica finale è anche importante, come il tessuto polmonare umano come dimostrato all’interno di questo studio. È necessario utilizzare tessuto umano perché l’entità del tessuto autofluorescence Mostra la grande variazione inter-specie e pertanto può indurre in errore la sensibilità della sonda-batteri essere imaged. Inoltre, ottenere etica per il recupero e utilizzo del tessuto polmonare umano è essenziale. Da un livello, corretta pulizia tecnica, allegato della fibra imaging per l’imaging LSU piattaforma e calibrazione è essenziale per la buona risoluzione e la formazione immagine coerenza, come è garantendo un numero equivalente di batteri è aggiunti per ogni campione di tessuto polmonare. Per espandere ulteriormente l’utilità di questo metodo per lo screening di pannelli di sonde, ripetendo la procedura con una gamma di agenti patogeni, come quelli di probabili agenti eziologici di polmonite è necessario.
Il più grande limite di questa tecnica è che il dispositivo CLE clinicamente approvato ha un solo laser (488 nm). Pertanto, attualmente, la selezione del fluoroforo per design della sonda è limitata per l’uso con questo sistema, anche se clinicamente approvato singolo colore esistono dispositivi con lunghezze d’onda di eccitazione di 660 nm e nel vicino infrarosso. È altamente auspicabile per avere una seconda linea di laser implementata all’interno del dispositivo stesso per consentire una sonda ad essere sviluppato con un fluoroforo spettralmente distinto per migliorare la sensibilità di batteri-sonda sopra il livello del tessuto autofluorescenza. Mentre i dispositivi dual-color CLE sono in fase di sviluppo, o sono clinicamente non approvati e/o il loro costo è significativo16.
CLE in vitro utilizzando batteri patogeni ed ex vivo tessuto polmonare umano per sonde potenziali schermo colma il divario tra convenzionale in vitro tecniche quali la citometria a flusso e CLSM e utilità clinica. Questo passaggio offre fiducia quando si seleziona composti promettenti per portare avanti per essere accoppiato con CLE clinico di imaging; e fornirà indicazione se la sonda testata mantiene la specificità di bersaglio, o viene illustrato qualsiasi etichettatura fuori bersaglio, ad esempio l’associazione direttamente al tessuto, o Mostra instabilità con host enzimi proteolitici. Inoltre sarebbe opportuno aggiungere ciascuna delle sonde attivabili direttamente ai campioni di tessuto polmonare umano più batteri, per caratterizzare la velocità della sonda associazione e attivazione in tempo reale.
Noi crediamo che la nostra pipeline di screening rapidamente nuove sonde di batteri specifici per valutare il loro potenziale per l’imaging all’interno del polmone distale dei pazienti si tradurrà in traduzione molto più veloce alla clinica. Questo è in gran parte perché la sonda di batteri specifici potrebbe essere recapitata localmente all’interno del polmone attraverso un catetere inserito lungo il canale di lavoro di un broncoscopio, significato che microdose (< 100 µ g) quantità potrebbe essere consegnato. Di conseguenza, consegna sistemica e biodistribuzione del composto non è una preoccupazione, come è il caso per molti altri obiettivi di infezione all'interno del corpo, o con imaging nucleare. Inoltre, offrendo la sonda imaging in una piccola dose riduce il rischio di tossicità relative complicazioni (anche se lo screening di tossicità sarebbe necessario per la traduzione). Dopo l'instillazione della sonda, il catetere potrebbe essere sostituito poi dalla fibra FCFM e della stessa regione del polmone interrogato da CLE, allo stesso modo abbiamo eseguito all'interno di questo metodo. La formazione immagine dovrebbe essere eseguita rapidamente dopo l'installazione della sonda prima la sonda lava via a concentrazioni inosservabili.
È anche importante notare che lo screening della malattia-identificazione sonde da questa tecnica non dovrebbe essere limitati agli agenti batterici-imaging, ma potrebbe anche estendersi alla validazione delle sonde con bersagli alternativi, come l’infiammazione. Questo approccio dovrebbe anche essere adattabile ad altre posizioni di malattia all’interno del corpo dove la formazione immagine via FCFM è ammissibile.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC, Regno Unito) collaborazione interdisciplinare di ricerca grant EP/K03197X/1, il dipartimento della sanità e il Wellcome Trust attraverso salute innovazione Challenge Fund (HICF) . Numero di riferimento del finanziamento: 0510-069.
1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |