这项技术描述了一个有效的筛选过程, 以评估细菌特异性光学成像剂在前体内人肺组织, 通过纤维共聚焦荧光显微镜快速鉴定小分子化学具有可翻译潜力的候选者。
提高细菌检测的速度和准确度对于患者的分层和确保适当使用抗菌素是非常重要的。为了实现这一目标, 需要发展诊断技术, 以识别细菌存在的 real-time 在点。在宿主内直接识别细菌的光学成像是一种有吸引力的方法。对化学探针设计和验证的几次尝试都进行了调查, 但是还没有成功地将其转化为临床。在这里, 我们描述了一个方法,前体内验证细菌特定的探针, 以确定细菌在远端肺部, 成像纤维共聚焦荧光显微镜 (FCFM)。我们的模型使用了前体人肺组织和一个临床认可的共焦激光内 () 平台, 以筛选新的细菌特异的成像化合物, 密切模仿的成像条件, 预计将遇到的病人。因此, 这种技术的筛选化合物提供了潜在的临床可的信心。
这项技术描述了一个快速筛选的过程, 以评估细菌特异性光学成像剂在前体内人肺组织通过使用 FCFM 的快速鉴定化合物的潜在临床实用的可视化在远端肺部的细菌原位。
在抗菌素耐药性上升的时代, 迫切需要对抗菌药物进行定量配给1。为此, 开发的诊断方法, 以确定细菌感染的高特异性, 灵敏度, 并在 real-time 是高度寻求2。目前确诊危重病人肺炎的技术, 如重症监护病房 (icu), 往往依赖于解释非特异性的临床或放射学特征和细菌培养技术, 从吸气液/组织, 这可能需要长达3天的结果。此外, 从流体灌输到远端肺和检索的细菌培养容易受到更多的近端气道3的污染, 而且由于伴随的抗菌疗法或抽样技术的不良, 往往是文化上的阴性。此外, 分子技术, 如聚合酶链反应是过于敏感, 当使用吸气液, 冒着过度的病人。一种新兴的诊断方法是分子光学成像, 使原位组织的分子病理学成为可能;然而, 光学成像化合物的开发和验证是必需的。然而, 通过激活光学探针直接可视化细菌, 可能是一种非常有力的方法, 可以研究肺炎在患者中的存在和演变, 而且重要的是, 可以用来研究宿主-病原体之间的相互作用。对治疗的反应在 real-time原位.
是一个已建立的多疾病调查程序4, 包括胃肠病学领域的5, 肿瘤科6,7, 并为审讯呼吸道和肺泡囊8,9. 它利用纤维成像束使病变组织的点结构成像, 通过临床内窥镜的工作通道, 并与组织表面直接接触, 并通过共聚焦显微镜成像。然而, 仍然存在的一个限制是需要通用的对比剂。因此, 使用疾病特定的探针, 如特定的细菌剂, 可以极大地扩大这种模式的效用, 直接可视化细菌在疑似感染部位。通过启用 real-time、高分辨率成像和诊断电位, 光学代理提供了许多优于其他技术的优势。此外, 光学探头提供了多路复用的前景, 用于审讯多个目标, 都以较低的成本实现。许多光学代理正在为此目的而开发, 但在诊所10内尚未成功实施。我们合成了一个专门针对细菌的小分子化学探针库, 并研制了一种快速有效的检测细菌性肺炎探头功能的管道,原位11。
为了确定合适的探头候选者, 必须在审讯前在对人体肺组织的 FCFM: i) 水溶解度, ii) 的探针之前完成以下先决条件临床上快速标记的特异性和选择性相关的细菌, iii) 高信噪比, 和 iv) 抵抗退化在肺环境之内。后者是由支气管肺泡灌洗液 (BALF) 的急性呼吸窘迫综合征 (ARDS), 这是一个条件的特点是蛋白水解和炎症环境的肺部在 ICU。此外, 探针必须有一个适当的荧光, 以检测由临床认可的光学在人肺肺泡组织的影像设备。
对每一个先决条件进行审问的管道如下 (在每个阶段, 只有通过的探针被结转到下一个): (1) 综合研究了探针库;(2) 每个探针被添加到一个活细菌的小组共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM), 以确保细菌标记;(3) CLSM co-cultures 与原人中性粒细胞建立的哺乳动物细胞的细菌标记选择性;(4) CLSM 和基质辅助激光解吸/电离-飞行时间 (MALDI) 质谱法测定 ARDS 患者 BALF 中存在的细菌的稳定性和成功标记;(5) 通过 CLSM 确定候选者的最佳浓度, 确保维持哺乳动物细胞细菌的选择性;(6) 候选人被 FCFM 在悬浮和在前体人肺肺泡组织中的影像, 以确保稳定性, 而信噪比是足够的检测。步骤6在本协议中详细描述。先前已报告了步骤 1-5 的方法11。
下呼吸道感染占疾病的第二高负担全球12,13, 并有大量增加的感染, 归因于耐药性细菌已报告14。肺炎仍然是住院的常见原因。在 ICU, 肺炎的发展因诊断不确定而复杂化, 并与极高的死亡率15有关。在肺炎爆发期间, 细菌在远端肺的肺泡间隙内增殖, 这是一个相对不育的区域, 在健康方面微生物最小。
此方法描述相对较晚阶段的前体验证特定于细菌的光学成像探头11, 但在开始此验证步骤之前的设计、合成和探头评估是必需的, 如前所示11.
real-time 是一种新兴的临床技术, 用于诊断疾病状态原位。它提供了许多优势比传统的技术, 调查疑似肺部病理, 这可能涉及活检和收集洗液。活检是侵入性的, 并可能导致发病率和死亡率在通风病人, 和收集的灌洗液经常污染的细菌从上呼吸道。然而, 尽管有许多协调一致的努力10, 但由于有可能提供疾病的功能性信息的兼容成像探头的可用性较差, 在肺炎检测中的使用却有些有限。与光学试剂相结合, 与目前的标准做法相比, 其诊断肺炎的速度更快, 创的可能性更小。
该协议的关键步骤是在示例准备和设置的平台。获得与最终临床应用相关的人体组织也很重要, 如本研究中所示的人肺组织。有必要使用人体组织, 因为组织自身荧光的程度表现出较大的间变异, 因此可能误导细菌探针的敏感性。此外, 获取和使用人类肺组织的伦理学是必不可少的。从技术层面上说, 正确的清洁、将成像纤维附着在图像处理平台上, 以及校准对于良好的分辨率和一致的成像是至关重要的, 因为这样可以确保每一个肺组织样本中都添加等量的细菌。为了进一步扩大这一方法的效用, 筛选面板的探针, 重复的程序与一系列的病原体, 如那些可能是致病剂的肺炎是必要的。
这项技术的最大限制是, 经临床批准的清洗设备只有一个激光器 (488 nm)。因此, 目前, 用于探针设计的荧光的选择是有限的与该系统的使用, 虽然临床认可的单一颜色的设备确实存在的激发波长 660 nm 和近红外。这是非常可取的, 有第二个激光线在同一设备内实现, 使探针开发与光谱独特的荧光, 以提高细菌探针灵敏度的组织自发荧光水平。虽然双色清洗设备正在开发中, 但它们不是经临床批准的, 或者它们的成本是显著的16。
体外使用病原菌和ex 体内人肺组织筛测电位探针可以弥合传统的体外分离技术, 如流式细胞仪和 CLSM, 以及临床应用。这一步提供了信心, 当选择有前途的化合物, 以进行结合临床的影像;并将提供指示测试探针是否保持目标特异性, 或演示任何不相干标记, 如直接绑定到组织, 或显示不稳定与宿主蛋白水解酶。另外, 将每个激活探针直接添加到人体肺组织和细菌样本中, 以充分刻画 real-time 中探针结合和活化的速度。
我们相信, 我们的管道快速筛选新的细菌特定的探针, 以评估其潜在的成像在远端肺部的病人将导致更快的翻译到诊所。这主要是因为细菌特定的探针可以通过导管插入支气管镜的工作通道在肺部局部传递, 这意味着微量 (< 100 µg) 的数量可以被传递。因此, 系统的交付和分布的化合物是不关心的情况下, 在许多其他感染目标的身体内, 或与核成像。此外, 在如此小的剂量下提供成像探头可以降低毒性相关并发症的风险 (尽管需要进行毒性筛查)。在注入探针之后, 导管就可以被 FCFM 纤维和同样的肺部区域所取代, 就像我们在这种方法中所做的那样。在探头安装探针之前, 应迅速进行成像, 然后将探针冲刷到无法探测到的浓度。
同样重要的是要注意, 通过这种技术筛选疾病鉴定探针不应局限于细菌成像剂, 但也可以扩展到对其他目标, 如炎症的探针的验证。这种方法也应适用于身体内的其他疾病部位, 通过 FCFM 成像是允许的。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢工程和物理科学研究理事会 (EPSRC, 英国) 跨学科研究合作赠款 EP/K03197X/1, 卫生署和惠康信托通过健康创新挑战基金 (HICF).供资参考编号: 0510-069。
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96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS – wash media |
IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |