Определение области оптических поперечных мышц Drosophila Melanogaster взрослых косвенные рейса мышц
Summary
Мы приводим метод количественного определения мышц области, которая является косвенным методом для определения мышечной массы у дрозофилы взрослых. Мы демонстрируем применение нашей методологии путем анализа косвенных полет мышцы в модели дрозофилы Миотонической дистрофии болезни.
Abstract
Мышечной массы тратить, известный как атрофия мышц, является общим фенотип в моделях дрозофилы нервно-мышечных заболеваний. Мы использовали косвенные полет мышцы (IFMs) мух, специально dorso продольные мышцы (DLM), как экспериментальная при условии меру, атрофический фенотип, вызванные различными генетическими причинами. В этом протоколе, мы описываем, как вставлять летать грудной мышцы для полу тонкой секционирование, как получить хороший контраст между мышц и окружающих тканей и как обрабатывать изображения оптический микроскоп для полуавтоматического приобретение количественных данных и анализ. Мы опишем три конкретных приложений методологических трубопровода. Во-первых мы покажем, как метод может быть применен для количественного определения дегенерации мышц в Миотонической дистрофии летать модели; Во-вторых измерение площади поперечного сечения мышцы может помочь выявить гены, которые либо способствовать, либо предотвращения атрофии мышц и/или мышечной дегенерацией; в-третьих, этот протокол может применяться для определения, является ли соединение кандидат сможет значительно изменить заданный атрофический фенотип, индуцированные мутации заболевани причиняяили экологических триггер.
Introduction
Грудная клетка плодовая муха содержит две различные классы полета мышц, которые функционально, физиологически и анатомически отличаются. Эти мышцы являются: косвенные полет мышцы (IFM), которые состоят из dorso продольная (DLM) и dorso вентральный (DVM) мышцы (рис. 1) и синхронных полета контролировать мышцы1,2. Вместе эти мышцы генерировать повышенной механической энергии, необходимые для полета. Размер, распределение и rostro хвостового распоряжения IFMs позволяют легко ориентации для поперечной секущей3 (рис. 2A). По этой причине мы выбрали эти мышцы для изучения атрофии мышц в Drosophila melanogaster.
Рисунок 1. Диаграмма грудной клетки плодовой мушки, показаны косвенные полет мышцы (IFMs) соглашения. (Слева) представляет собой вид сбоку и (справа) представляет собой сечения грудной клетки. IFMs состоят из Dorso продольная (DLM) мышц (в красном) и Dorso вентральный (DVM) мышцы (в зеленом).
Сохранение структуры ткани и контроль над ориентации оси dorso вентральной Гистологические срезы решающее значение для обеспечения надлежащей оценки площади поперечного сечения мышцы. Чтобы сохранить структуру мышц мы использовали смесь фиксации изменения от Томлинсон и др. 4 . Кроме того потому что мышцы внутренних тканей, непроницаемости дрозофилыэкзоскелет представляет собой проблему как фиксации, что смеси не может проникнуть в тканях-мишенях. Чтобы обойти эту проблему, мы удалили летать голова, ноги, крылья и две последние сегменты живота для создания отверстия, которые позволили фиксации смесь ввести. В рамках протокола фиксации, мы включили лечения с осмия тетраоксид (4OsO)5, который широко используется из-за его способности исправить жиров, в том числе триглицеридов. OsO4 сохраняет большинство структур чрезвычайно хорошо, особенно на уровне цитологического и в то же время обеспечивает контраст изображения. После фиксации дрозофила thoraces были внедрены в смолы для поперечной полутонкая резания (1,5 мкм). Для повышения контраста ткань может быть дополнительно окрашенных толуидиновый синий. Изображения полного thoraces были взяты на 10 X и мышц области был количественно binarizing изображения (равных размеров) и количественного определения процент пикселей, соответствующий мышечной ткани (черных точек) из всего, с ImageJ программного обеспечения.
Изменения на ткани подготовки и фиксации смеси, как увеличение концентрации раствора OsO4 и глютаральдегид, представил в настоящем Протоколе, позволило уникальный сохранение мышечной ткани. Это потому, что протокол позволяет избежать деградации и деформации ткани, делая задняя анализ образцов более надежным даже в весьма атрофический условий, связанных с нервно-дегенеративные заболевания такие как Миотонической дистрофии (DM). В своей более общей форме, DM типа 1, это редкое генетическое заболевание вызвано расширенной заг повторяется в стенограммы протеинкиназы Миотонической дистрофии (DMPK). Мутант DMPK РНК агрегатов очагов ribonuclear формы, которые секвестр Muscleblind как ядерные RNA-связывая протеинов (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) у дрозофилы)6. Мы создали модель дрозофилы Миотонической дистрофии выразить 250 CTG-повторов в мышечной миозин тяжелые цепи промоутер (Mhc-Gal4). Модели мух были нелетающих с типичной «провел вверх крылья» фенотип и серьезный мышечные атрофии в их IFMs (рис. 2B). Предыдущие исследования выполняются в нашей лаборатории показали, что определение области мышц IFMs является надежным методом для количественной оценки воздействия различных химических или генетических модификаторы атрофии мышц в этих мух модель7. Как, например гиперэкспрессия изоформы Mbl, которую C в мух, выражая 250 КТГ повторяется в мышцу, достичь спасения мышц области, как истощение Mbl путем поглощения является пусковым фактором DM1 патогенеза8 (рис. 2 c). Мышц области также был спасен после кормления модель DM летит с Abp1, гексапептида с проверенной анти DM1 деятельность9 (Рисунок 2D).
Рисунок 2. Количественная оценка dorsoventral слоев смолы встроенный взрослых thoraces. (A-D) косвенные полет мышцы Drosophila melanogaster с указанной соответствующих генотипов. (A) управления мухи (yw). (Б) выражение 250 некодирующих КТГ повторяется в мышцах (UAS-CTG(250)x) вызвало сокращение мышц области в DLMs по сравнению с контролем мух. (C) этот фенотип атрофия мышц был спасен Сверхэкспрессия Muscleblind (MblC) (UAS-КТГ (250) x бла-MblC) и (D) кормления модель мух с гексапептида Abp1 (бас-КТГ (250) x Abp1). Во всех изображениях спинной стороне находится на вершине. Трансгенов были вынуждены мышц с помощью промоутера тяжелой цепи миозина (Mhc)-Gal4. (E) количественной оценки доли мышц области относительно мух управления подтвердил, что различия были значительными. Гистограмма показывает средства ± S.E.M. **p< 0.01 и * p < 0,05 (Student´s t тест). Линейки: 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Метод здесь сообщили будет представлять интерес для исследователей, упором на развитие мышц, обслуживания и старения, болезни патологии и наркологическая экспертиза как она обеспечивает надежную информацию о как мышечная ткань реагирует как внутреннего, так и внешних факторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Было продемонстрировано, что дрозофилы является полезной моделью для изучения нервно-мышечных заболеваний человека7,10,11, включая Миотонической дистрофии, которые характеризуются внешний вид мышечной атрофии. Протокол, представл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить членов трансляционной геномике группы и Кэтрин J Hanson для обратной связи и улучшения по этому протоколу. Этот проект осуществлялся с исследовательский грант SAF2015-64500-R, который включает в себя европейских региональных фондов развития, присуждена Ministerio де Economia y развитию Р.А.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223 (2014).
