קביעת אזור שרירים חתך הרוחב אופטי שרירי תעופה עקיף למבוגרים דרוזופילה Melanogaster
Summary
. מדווחים שיטה לכמת שרירים באזור, אשר היא שיטה עקיפה כדי לקבוע את מסת השרירים במבוגרים דרוזופילה . נדגים היישום של המתודולוגיה שלנו על-ידי ניתוח הטיסה עקיף השרירים במודל דרוזופילה ממחלת ניוון שרירים חולים Myotonic.
Abstract
מסת השריר, מבזבז את המכונה ניוון שרירים, הוא הפנוטיפ הנפוץ דרוזופילה דגמים של מחלות נוירומוסקולריות. השתמשנו השרירים טיסה עקיף (IFMs) של זבובים, במיוחד dorso-האורך השרירים (DLM), כמו ניסיוני על מידה פנוטיפ מנוונת הביא על ידי גורמים גנטיים שונים. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד להטביע את שרירי החזה לטוס חלוקתה דק חצי כיצד להשיג קונטרסט טוב בין השריר ואת הרקמה הסובבת, כיצד לעבד תמונות מיקרוסקופ אופטי עבור רכישת חצי אוטומטי של מידע כמיתים, ניתוח. אנו מתארים שלושה יישומים ספציפיים של הצינור מתודולוגי. ראשית, אנו מראים איך ניתן להחיל את שיטת לכמת ניוון שרירים במודל לטוס ניוון חולים myotonic; שנית, מדידה של שטח חתך הרוחב שריר יכול לעזור לזהות גנים לקדם או למנוע ניוון שרירים ו/או ניוון שרירים; שלישית, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לקבוע אם תרכובת המועמד הוא אפשרות לשנות באופן משמעותי את הפנוטיפ מנוונת נתון המושרה על ידי מוטציה גורמי מחלותאו על-ידי של גורם סביבתי.
Introduction
בית החזה של זבוב הפירות מכיל שתי מחלקות שונות של שרירי תעופה, אשר הן מבחינה תפקודית, פיזיולוגית והן מבחינה אנטומית נפרדות. שרירים אלו: השרירים טיסה עקיף (IFM), אשר מורכבים של אורכי-דורסו (DLM) dorso-הגחוני / (DVM) השרירים (איור 1), ואת הטיסה סינכרונית לשלוט בשרירים1,2. השרירים האלה יחד ליצור את הכוח מכני מוגברות הדרושים עבור הטיסה. תפוצה וגודל, הוצאת rostro-סימטרית IFMs מאפשרים התמצאות קלה עבור אופטים ואלכסוני3 (איור 2 א). מסיבה זו, בחרנו את השרירים האלה ללמוד הניוון שרירים melanogaster דרוזופילה.
איור 1. תרשים של בית החזה של זבוב הפירות מציג השרירים טיסה עקיף סידור (IFMs). (משמאל) מייצג תצוגה לרוחב ו (מימין) מייצג חתך רוחב של בית החזה. IFMs מורכבים של השרירים האורך דורסו (DLM) (באדום), Dorso-הגחוני / (DVM) השרירים (בירוק).
שימור מבנה רקמות והשליטה dorso-הגחוני / ציר הכיוון של מקטעים היסטולוגית הם קריטיים כדי להבטיח הערכה נכונה של שטח חתך הרוחב שריר. כדי לשמר את מבנה השריר שהשתמשנו תערובת קיבוע שונה טומלינסון. et al. 4 . יתר על כן, בגלל שרירי רקמות פנימיות, אטימות של שלד של דרוזופילההוא בעיה קיבוע תערובות לא מצליח לחדור לרקמות היעד. כדי לעקוף בעיה זו, הסרנו בראש לעוף, רגליים, כנפיים, לאחרונה שני מגזרים של הבטן ליצירת חורים אשר איפשר את התערובת קיבוע להיכנס. במסגרת פרוטוקול קיבוע שכללנו טיפול עם אוסמיום ארבע-חמצני (OsO4)5, המשמש בהרחבה בשל יכולתה נתקן שומנים, לרבות טריגליצרידים. OsO4 שומר על רוב המבנים מאוד טוב, במיוחד ברמה cytological, באותו זמן ומספק החדות של התמונה. לאחר קיבוע, דרוזופילה thoraces הוטבעו שרף על חציה למחצה דק אופטים (1.5 מיקרומטר). ‘ ניגוד ‘ משופר, רקמות יכול להיות בנוסף מוכתם טולדין כחול. תמונות של thoraces מלאה צולמו ב-10 X, שרירים באזור הייתה לכמת על-ידי binarizing תמונות (של ממדים שווים) וכימות אחוז של פיקסלים על רקמת השריר (פיקסלים שחורים) מתוך סה כ, בעזרת תוכנת ImageJ.
שינויים רקמות קיבוע והכנה תערובות, כמו עליית ריכוז OsO פתרון4 ו גלוטראלדהיד, הציג את פרוטוקול זה, מותר ייחודי שימור רקמת השריר. זה כי הפרוטוקול מונע את ההשפלה ואת דפורמציה של הרקמה, ביצוע ניתוח האחורי של הדגימות אמין יותר גם בתנאים מאוד מנוונת המשויך neuromuscular מחלות ניווניות כגון ניוון חולים Myotonic (DM). בצורתו נפוץ יותר, מיט סוג 1, הפרעה גנטית נדירה זו הוא הביא על ידי חזרה CUG המורחב של תעתיקים ניוון חולים myotonic קינאז (DMPK). מוטציה DMPK RNA אגרגטים מוקדים ribonuclear טופס זה sequester את Muscleblind כמו גרעיני RNA מחייב חלבונים (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) בדרוזופילה)6. יצרנו מודל דרוזופילה של ניוון חולים Myotonic בהבעת 250 חזרה CTG תחת מקדם מכירות שרשרת כבדה שרירים צולבות הקישור חוטים שרירן (Mhc-Gal4). זבובים דגם היו לעוף עם פנוטיפ אופייני ‘שנערך למעלה כנפיים’ והיו שרירים חמורה להתנוון ב שלהם IFMs (איור 2B). מחקרים קודמים שבוצעו במעבדה שלנו הראו כי קביעת אזור שרירים של IFMs היא שיטה אמינה לכמת את השפעות שונות כימי או גנטי מודיפיקטורי הניוון שרירים אלה זבובים דגם7. לדוגמה, ביטוי של isoform Mbl C בזבובים לבטא את CTG 250 חוזר לשריר, מושגת הצלה של שרירים באזור, כמו דלדול Mbl מאת פחמיות הוא גורם מפעילה DM1 פתוגנזה8 (איור 2C). שרירים באזור חולץ גם לאחר האכלה דגם DM טס עם Abp1, האקסאפאפטיד עם פעילות מוכחת אנטי-DM19 (איור דו-ממדי).
באיור 2. כימות של קטעים dorsoventral של שרף-מוטבע thoraces למבוגרים. (י-ם) טיסה עקיף שרירי דרוזופילה melanogaster עם אחרים רלוונטיים המצוין. (א) שליטה זבובים (yw). (ב) ביטוי של 250 ללא קידוד CTG חוזר בשריר (UAS-CTG(250)x) גרמה ירידה של שרירים באזור של DLMs לעומת שליטה זבובים. (ג) זה פנוטיפ ניוון שרירים ניצל ע י ביטוי של Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) (D) מאכילים את הזבובים דגם עם האקסאפאפטיד Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). כל התמונות הצד הגבי הוא על העליונה. Transgenes גורשו אל שריר באמצעות מקדם כבד-שרשרת צולבות הקישור חוטים שרירן (Mhc)-Gal4. (ה) כימות אחוזי השריר באזור יחסית הזבובים שליטה אישר כי ההבדלים היו משמעותיים. ההיסטוגרמה מציגה אמצעי ± S.E.M. * *p< 0.01 ו * p < 0.05 (Student´s-t-test). סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
שיטת דיווח כאן יהיה עניין לחוקרים התמקדות פיתוח שרירים, תחזוקה, הזדקנות, המחלה פתולוגיה, בדיקות סמים כפי שהיא מספקת מידע אמין על כיצד רקמת השריר יגיב לגורמים אנדוגניים וחיצוניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הוכח כי melanogaster דרוזופילה הוא מודל שימושי ללמוד האנושית מחלות נוירומוסקולריות7,10,11, כולל Dystrophies חולים Myotonic, אשר מאופיינים במראה ניוון שרירים. פרוטוקול המוצג כאן הוא כלי שימושי עבור לכימות ניוון שרירים שנגרם על ידי התפרצות או התקדמות ש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות חברי קבוצה גנומיקה Translational ו קתרין J הנסון עבור ההזנה-הגב ושיפורים על פרוטוקול זה. הפרויקט בוצע עם מענק מחקר SAF2015-64500-R, הכולל האירופית קרנות לפיתוח אזורי, מוענק R.A מאת y Ministerio דה Economia Competitividad.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
- Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113, 67-77 (1991).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H. Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds. Development. 122, 3755-3763 (1996).
- Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).
- Griffith, W. P. Osmium Tetroxide And Its Applications. Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).
- Bird, T. D. Myotonic Dystrophy Type 1. GeneReviews. 1, 1-23 (1993).
- Bargiela, A., et al. Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model. Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).
- Llamusi, B., et al. Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model. Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).
- García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).
- van der Plas, M. C., et al. Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature. Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila. J. Vis. Exp. , e51223 (2014).
