Determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de Drosophila Melanogaster
Summary
Nós relatamos um método para quantificar a área do músculo, que é um método indireto para determinar a massa muscular em adultos de Drosophila . Demonstraremos que a aplicação de nossa metodologia, analisando o voo indirecto musculares em um modelo de drosófila de doença distrofia miotônica.
Abstract
Massa muscular, perdendo, conhecida como atrofia muscular, é um fenótipo comum em Drosophila modelos de doenças neuromusculares. Nós usamos os músculos de voo indirecto (IFMs) de moscas, especificamente os músculos dorso-longitudinal (DLM), como o experimental sujeito a medida que o fenótipo atrófico provocado por causas genéticas diferentes. Neste protocolo, descrevemos como incorporar os músculos do tórax voar para corte fino de semi, como obter um bom contraste entre o músculo e do tecido circundante e como processar imagens de microscópio ótico para aquisição semi-automática de dados quantificáveis e análise. Nós descrevemos três aplicações específicas do pipeline metodológica. Primeiro, mostramos como o método pode ser aplicado para quantificar a degeneração muscular em um modelo de distrofia miotônica voar; em segundo lugar, a medição da área transversal do músculo pode ajudar a identificar genes que promovem ou evitem a atrofia muscular e/ou degeneração muscular; em terceiro lugar, este protocolo pode ser aplicado para determinar se um candidato composto é capaz de modificar significativamente um determinado fenótipo atrófico induzido por uma doença-causando mutaçãoou por um gatilho ambiental.
Introduction
O tórax de mosca da fruta contém duas classes diferentes dos músculos de voo, que são funcionalmente, fisiologicamente e anatomicamente distintas. Estes músculos são: os músculos de voo indirecto (IFM), que são compostos de dorso-longitudinal (DLM) e músculos dorso-ventral (DVM) (Figura 1) e o voo síncrono controlam músculos1,2. Estes músculos juntos geram a elevada potência mecânica necessária para o voo. O tamanho, a distribuição e a disposição rostro-caudal dos IFMs permitam uma fácil orientação para corte transversal3 (Figura 2A). Por esta razão, nós selecionamos estes músculos para estudar a atrofia muscular em Drosophila melanogaster.
Figura 1. Diagrama do tórax da mosca da fruta, mostrando os músculos de voo indirecto (IFMs) disposição. (Esquerda) representa uma vista lateral e (direita) representa uma seção transversal do tórax. Os IFMs são compostas dos músculos Dorso-longitudinal (DLM) (em vermelho) e o Dorso-ventral (DVM) músculos (em verde).
Preservação da estrutura do tecido e o controle sobre a orientação do eixo dorso-ventral dos cortes histológicos são críticos para garantir uma avaliação adequada da área transversal do músculo. Para preservar a estrutura muscular, usamos uma mistura de fixação modificada de Tomlinson et al 4 . Além disso, porque os músculos são tecidos internos, a impermeabilidade da drosófilado exoesqueleto é um problema como fixação misturas não podem penetrar os tecidos-alvo. Para contornar este problema, nós removemos a cabeça voar, pernas, asas e os dois últimos segmentos do abdome para criar buracos que permitiram a mistura de fixação entrar. Como parte do protocolo de fixação, que incluímos o tratamento com tetróxido de ósmio (OsO4)5, que é amplamente utilizado devido à sua capacidade de corrigir as gorduras, incluindo os triglicerídeos. OsO4 preserva a maioria das estruturas extremamente bem, particularmente a nível citológico e ao mesmo tempo proporciona o contraste da imagem. Após a fixação, Drosophila thoraces foram embutidos em resina para transversal semi fina corte (1,5 µm). Para melhor contraste, tecido pode ser adicionalmente manchado com toluidina azul. Imagens de thoraces completas foram tiradas em 10 X e área muscular foi quantificada por binarizing imagens (de dimensões iguais) e quantificar a percentagem de pixels correspondente ao tecido muscular (pixels pretos) total, com software ImageJ.
Modificações no tecido preparação e fixação misturas, como o aumento da concentração da solução de4 e glutaraldeído OsO, introduzida no presente protocolo, permitido exclusiva preservação do tecido muscular. Isso ocorre porque o protocolo evita a degradação e a deformação do tecido, tornando a análise posterior das amostras mais confiável, mesmo em condições altamente atróficas associadas com doenças degenerativas neuromusculares tais como distrofia miotônica (DM). Na sua forma mais comum, DM tipo 1, esta desordem genética rara é provocada pela expandido CUG repetições em transcrições de proteína quinase de distrofia miotônica (DMPK). Mutante DMPK RNA agrega focos de ribonuclear de forma que sequestram as Muscleblind como nuclear RNA-proteínas (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) em Drosophila)6. Geramos um modelo de drosófila de distrofia miotônica expressando 250 repetições CTG sob o promotor de cadeia pesada de miosina muscular (Mhc-Gal4). Modelo moscas foram incapazes de voar com um fenótipo típico ‘up-realizado asas’ e tinham muscular grave atrofia em seus IFMs (Figura 2B). Estudos anteriores realizados em nosso laboratório mostraram que a determinação da área muscular do IFMs é um método confiável para quantificar os efeitos de diferentes modificadores químicos ou genéticos o atrofiamento muscular nestas moscas modelo7. Como exemplo, superexpressão de Mbl isoforma C em moscas, expressando o CTG 250 se repete no músculo, alcançado um resgate da área do músculo, como Mbl depleção por sequestro é o fator desencadeante em DM1 patogênese8 (Figura 2). Área do músculo também foi resgatada depois de alimentar o modelo DM voa com Abp1, um Hexapeptídeo com anti-DM1 comprovada atividade9 (Figura 2D).
Figura 2. Quantificação das secções dorsoventral da resina-incorporado thoraces adultos. Músculos de voo indireta (A-D) de Drosophila melanogaster com os genótipos relevantes indicados. (A) controle de moscas (yw). (B) a expressão de 250 não-codificantes CTG se repete no músculo (UAS-CTG(250)x) causou uma redução da área de músculo na webcam em comparação com o controle de moscas. (C) este fenótipo de atrofia muscular foi resgatado pela superexpressão de Muscleblind (MblC) (UEA-CTG (250) x UAS-MblC) e (D) alimentando as moscas de modelo com o Hexapeptídeo Abp1 (UEA-CTG (250) x Abp1). Em todas as imagens do lado dorsal está no topo. Transgenes foram impulsionadas a muscle usando um promotor de cadeia pesada de miosina (Mhc)-Gal4. (E) a quantificação da percentagem de área muscular relativo para as controle de moscas confirmou que as diferenças foram significativas. O histograma mostra meios ± no MEV mostrou * *p< 0,01 e * p < 0,05 (Student´s t-teste). Barra de escala: 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O método aqui relatado será de interesse para pesquisadores, com foco no desenvolvimento muscular, manutenção e envelhecimento, patologia da doença e teste de drogas, pois fornece informações confiáveis sobre como o tecido muscular responde a fatores endógenos e externos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Foi demonstrado que a Drosophila melanogaster é um modelo útil para estudar doenças neuromusculares humanas7,10,11, incluindo distrofias miotônicas, que se caracterizam pelo aparecimento de atrofia muscular. O protocolo aqui apresentado é uma ferramenta útil para quantificar a degeneração muscular causada pelo aparecimento ou progressão de uma doença específica em um modelo de voar. Por exemplo, também é po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer os membros do grupo de genômica translacional e Kathryn J Hanson para o feed-back e as melhorias no presente protocolo. Este projeto foi realizado com bolsa de pesquisa SAF2015-64500-R, que inclui fundos europeus de Desenvolvimento Regional, concedido ao Ramalho pelo Ministerio de Economia y competitividade.
Materials
| Image-J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Ultramicrotome | Leica | Leica UC6 | |
| Microscope | Leica | Leica MZ6 | Bright field technique. |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Several alternative providers exist. |
| Scissors | World Precision World | 14003 | Several alternative providers exist. |
| Embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70900 | Several alternative providers exist. |
| Glutaraldehyde | Fluka (Sigma) | 49624 | Toxic. |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | Extremely toxic. |
| Propylene oxide | Sigma Aldrich | 82320-250ML | Extremely toxic. |
| resin (Durcupan) | Sigma Aldrich | 44611-44614 | Carcinogenic when it is unpolymerized. |
| Toluidine blue | Panreac | 251176 | Toxic. |
| Mountant Medium (DPX) | Sigma Aldrich | 44581 | Dangerous. |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-500G | Harmful. |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M dilution. |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M dilution. |
| Borax | Panreac | 3052 | Toxic. |
References
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