Um imunoensaio baseado no capilar, usando uma plataforma comercial para medir as proteínas alvo de preparações de proteína total é demonstrado. Além disso, o ensaio parâmetros de tempo de exposição, concentração de proteína e diluição de anticorpo são otimizados para um sistema de modelo de cultura de células.
Novas tecnologias que utilizam os imunoensaios baseados em capilar prometem avaliação mais rápida e mais quantitativa de proteínas em comparação com os imunoensaios tradicionais. No entanto, semelhante a outros ensaios de proteína baseada em anticorpos, otimização dos parâmetros de imunoensaio baseado no capilar, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é um requisito importante para a geração de significativos e confiáveis dados. Medições devem cair dentro da escala linear do ensaio onde as alterações no sinal são diretamente proporcionais às mudanças na concentração de lisado. O processo de escolha de concentrações adequadas de lisado, diluições de anticorpo e tempos de exposição na linha de células epiteliais brônquicas humanas, BEAS-2B, é demonstrado aqui. Ensaio de linearidade é mostrada em um intervalo de concentrações de proteína de extrato celular com anticorpos p53 e α-tubulina. Um exemplo de burnout sinal é visto as concentrações mais elevadas com longos tempos de exposição, e uma curva de diluição do anticorpo de α-tubulina é mostrada demonstrando a saturação. Além disso, resultados experimentais de exemplo são relatados para células tratados com doxorrubicina usando parâmetros otimizados.
Os imunoensaios electroforese capilares medem a expressão da proteína em lisados celulares usando sistemas de separação de tamanho ou carga e oferecem várias vantagens sobre os tradicionais imunoensaios. Por exemplo, quando comparado ao borrão ocidental, o procedimento automatizado baseado em capilar Elimina a necessidade de géis, dispositivos de transferência, e manual de lava. Além disso, a quantidade absoluta de proteína necessária é aproximadamente 10 vezes menor, tornando a sistemas baseados em capilar ideal para uso com tipos de células raras ou amostra limitada1,2. Os resultados são obtidos em menos de 3 h, usando sistemas automatizados e anteriormente tenha sido demonstrados mais quantitativa e reprodutível do que ocidental convencional borre procedimentos3,4,5. O processo para ensaios baseados em tamanho consiste em carregar amostras contendo sulfato dodecyl de sódio (SDS), ditiotreitol (DTT) e fluorescente etiquetado marcadores de peso molecular em colunas capilares contendo matrizes de empilhamento e separação. Tensão aplicada aos capilares separa as proteínas nas amostras de acordo com o tamanho, e a luz UV imobiliza as proteínas separadas na parede capilar. O capilar é então imuno-sondado com alvos primário anticorpo e horseradish peroxidase (HRP)-anticorpo secundário conjugado. Luminol e peróxido de catalisam a geração de luz quimioluminescente que é medida por uma câmera do dispositivo acoplado (CCD) de carga e analisada para dosar proteínas.
Apesar da relativa facilidade e velocidade de uma plataforma automatizada baseada em capilar eletroforética imunoensaio, otimização das condições de ensaio, tais como a concentração de proteína, anticorpo diluição e tempo de exposição é importante para a obtenção de precisas, reprodutíveis resultados. Em geral, os procedimentos a seguir devem ser executados para otimizar um ensaio para estes sistemas:
1) uma tela deve ser realizada para avaliar e escolher os anticorpos para o sinal e especificidade para o destino de proteína. Se disponível, a proteína purificada ou epítopo alvo pode ser usado para avaliar a especificidade; no entanto, ainda é importante avaliar o potencial sinal específico em proteínas totais provenientes do sistema de modelo.
2) em seguida, a gama dinâmica do ensaio precisa ser determinado. Em uma situação ideal, duplicação de sinal (medido usando a área do pico) é observada como a concentração da amostra é duplicada; no entanto, na prática, uma mudança proporcional no sinal de entrada de forma previsível (por exemplo, linear caber) é suficiente para quantificação de proteína. Além disso, essa otimização irá definir a concentração de proteína com sinal elevado, mas ainda dentro da escala linear para o modelo experimental.
3) determine a concentração de anticorpo usando a concentração de proteína fixo escolhida na etapa de otimização 2. À medida que aumenta a concentração de anticorpos, o sinal aumenta até que platôs na saturação. Uma concentração de anticorpo perto deste nível de saturação é necessária para a medição da concentração da proteína.
O processo usado para otimizar as concentrações de proteína, diluições de anticorpo e tempos de exposição para um ensaio de automatizado baseado em capilar tamanho6 é demonstrado utilizando extratos de células inteiras isolados de BEAS-2B, um humano transformado SV-40 brônquico linhagem de células epiteliais. Isolamento da proteína de extratos de células ou tecidos pode ser realizado usando um número de protocolos publicados7,8,9 e não será coberto aqui. Resultados de um experimento experimental usando as condições otimizadas são também relatados para total e fosforilados (serina 15, serina 20) p53 em culturas expostos a doxorrubicina (um comum agente quimioterapêutico que induz a apoptose de células10) em 1.2, 1.8, e mídia de 2,4 µ g/mL para 4 h antes da colheita. As áreas de pico de p53 são normalizadas para ɑ-tubulina, que é usado como um controle de carregamento.
Por décadas, tem havido interesse sustentado no desenvolvimento de métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar por causa da baixa amostra e reagente despesas, diminuída de processamento tempo quando comparado aos métodos tradicionais e alta compatibilidade para Automatize o procedimento4,15. Há um número de diferentes protocolos para a separação de proteínas que utilizaram capilares, incluindo polímero eletroforético, electrokinetic, peneirar e métodos isoelétrico que isolar proteínas pelas propriedades diferentes (respectivamente, carga eletrostática, equilíbrio de partição, peneirando Propriedades da matriz da separação e pH)16. Aqui, descrevemos um método de eletroforese capilar baseado em anticorpos (ou imunoensaio), usando um polímero peneirando a separação, que foi automatizada e comercialmente adotado3. As vantagens deste sistema incluem facilidade de uso e operação, padronizados e comercialmente disponíveis reagentes e medições confiáveis, sensíveis que exigem menos reagentes e amostras em comparação com ensaios de proteína tradicionais tais como borrão ocidental, ligado à enzima imunoensaio e outros formatos de4,3,5. Tem-se observado nas avaliações anteriores desta tecnologia que a escala do tamanho da proteína que pode ser avaliada tem sido limitada pela separação disponível matriz4, ofertas no entanto recentes têm expandido o mensurável variam de 2 a 440 kDa17 . Além disso, alguns buffers lisados são conhecidos por serem incompatíveis com o ensaio18, portanto seleção dos reagentes experimentais utilizado deve ser considerada antecipadamente.
Uma grande vantagem de um procedimento automatizado com componentes disponíveis comercialmente é a consistência dos resultados através de métodos padronizados e reagentes. Isso minimiza as chances de fracasso de ensaio, automatizando etapas críticas dentro do procedimento. No entanto, é importante notar que certas práticas devem ser respeitadas durante o protocolo para minimizar problemas com o imunoensaio baseado em eletroforética capilar. Em primeiro lugar, é fundamental que a mistura de luminol-S/peróxido é preparada fresco e imediatamente antes placa de carregamento. Sincronismo consistente irá resultar em luminescência consistente após o agente oxidante é adicionado, o que resultará em medições consistentes para um ensaio de anticorpo específico depois do ensaio. Além disso, é importante que os reagentes não-expirado são usados, que afeta principalmente a potência do agente oxidante. Além disso, é importante que a ordem de carregamento de amostras, anticorpos e outros reagentes ser rigorosamente seguidas (ver Figura 1). Qualquer reagente pipetado fora do lugar irá resultar em falha de ensaio e executar um desperdício.
Além desses passos críticos, principais questões experimentados com a técnica geralmente podem ser superados através de otimização. Com efeito, estas condições são específicas para cada combinação de sistema/anticorpo de modelo e, portanto, devem ser determinadas empiricamente para cada novo ensaio. Neste artigo, enfocamos três procedimentos comuns de otimização: tempo de exposição, titulação lisada e diluição do anticorpo primário. A capacidade de gerar resultados mensuráveis depende da análise de um tempo de exposição quando o substrato de luminol não é ser rapidamente esgotado, como resultado de depleção de substrato em perda de sinal. Lisado titulação determina a gama dinâmica linear de cada ensaio, que pode diferir com sistemas de modelo diferente, bem como anticorpos diferentes, mesmo para o mesmo destino de proteína. Diluições de anticorpo escolhidas em ou perto de saturar as concentrações garantir mudanças no sinal não serão afetadas por uma escassez de anticorpo livre, mas apenas por diferente quantidade de proteína disponível alvo epítopo. Outras considerações durante o processo de otimização podem incluir o tempo de incubação do anticorpo e empilhamento/amostra tempo de carregamento. Na maioria dos casos, as configurações padrão para o instrumento oferecem o melhor equilíbrio de resolução e sensibilidade. No entanto, em alguns casos, pobre resolução ou sensibilidade pode ser melhorada por ajustar esses parâmetros.
Capilar de imunoensaio eletroforética com base em métodos fornecem medições de proteína rápida, eficiente e reprodutível. Enquanto esses métodos têm sido utilizados principalmente em configurações de pesquisa e desenvolvimento, a coerência destas tecnologias tem potencial utilidade em aplicações clínicas e regulamentares. Por exemplo, a identificação de subpopulações sensíveis a tóxicos ambientais ou pacientes com progressão da doença pode basear-se nos biomarcadores de proteína medidos em matrizes acessíveis, como sangue, urina e saliva. Como reagente e queda de custos de operação e o número de amostras e alvos que podem ser avaliadas simultaneamente aumenta, provavelmente veremos métodos de imunoensaio baseado em eletroforética capilar usados para esses tipos de aplicativos.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria de agradecer Keith Tarpley nos EPA escritório da equipe de pesquisa e desenvolvimento-Research Triangle Park (ORD-RTP) gráfico e mídia para o desenvolvimento, gravação e edição de vídeo instrucional. Também gostaríamos de agradecer a Deborah Pritchett de ProteinSimple útil conversas sobre otimização de nossos dados,. JM Guynn foi apoiado pelo Instituto de Oak Ridge para ciência e educação programa de pesquisa/participação nos Environmental Protection Agency.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |