総蛋白製剤からの薬物の標的タンパク質を測定する商用プラットフォームを用いたキャピラリーを用いた免疫測定法が示されています。さらに、露光時間、タンパク質濃度と抗体希釈アッセイ パラメーターは、細胞培養モデル系に最適です。
キャピラリーを用いたイムノアッセイを活用する新しい技術は、伝統的なイムノアッセイと比較してより速くより定量的なタンパク質評価をお約束します。他の抗体を用いた蛋白質の試金と同様に、タンパク質濃度、抗体希釈露光時間などの毛細血管に基づく免疫パラメーターの最適化は、意味のある、信頼性の高いの世代に重要な前提条件データ。測定は、信号の変化、溶解濃度の変化に直接比例アッセイの線形の範囲内でなければなりません。ひと気管支上皮細胞ライン、ベアス-2B の適切な溶解液濃度、抗体希釈液と露光時間の選択のプロセスは、ここに示されています。アッセイの直線性は、p53 および α-チューブリン抗体と全細胞抽出タンパク濃度の範囲で表示されます。信号燃え尽き症候群の例が長い露光時間で最高濃度に見え、彩度を示す α-チューブリン抗体希釈曲線が表示されます。さらに、実験結果の例は、ドキソルビシン治療細胞最適化されたパラメーターを使用して報告されます。
キャピラリー電気泳動イムノアッセイ サイズまたは電荷分離システムを使用してセル lysates の蛋白質の表現を測定し、従来免疫上のいくつかの利点を提供します。たとえば、ゲル、転送デバイス、必要西部のしみと比較して、自動キャピラリー ベースのプロシージャがなくなり、マニュアルを洗います。さらに、必要なタンパク質の絶対量が約 10 倍小さくなりますので毛細血管系稀または限られたサンプル1,2での使用に最適。結果は自動システムを使用して 3 時間ほどで得られるし、以前より定量的で従来の西部よりも再現性が示されている手順3,4、5のしみ。サイズに基づく試金のためのプロセスはドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ジチオトレイトール (DTT) のサンプルをロードで構成され、分子量マーカーをスタッキングと分離行列を含むキャピラリーカラムに蛍光ラベルします。毛細血管への電圧はサイズにより試料中のタンパク質を分離し、UV 光が毛細血管壁に分けられた蛋白質を固定化します。毛細血管は、ターゲット固有一次抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) に免疫をプローブ-共役二次抗体。ルミノール及び過酸化物触媒化学発光の光生成電荷結合素子 (CCD) カメラによる測定は、蛋白質を量的に分析をします。
相対的な容易さ、自動キャピラリーを用いた電気泳動イムノアッセイ プラットフォームの速度にもかかわらず、蛋白濃度、抗体の希釈、露光時間など測定条件の最適化は、正確で再現性を得るため重要結果。一般に、これらのシステムの分析を最適化するために次の手順を実行する必要があります。
1) 画面を実行して、評価し信号の蛋白質ターゲットに特異的抗体を選択ください。の特異性を評価する場合は、浄化された蛋白質またはターゲット エピトープを使用できますただし、総蛋白質モデル システムから供給の潜在的な非固有の信号を評価することが重要です。
2) 次に、測定のダイナミック レンジを決定する必要があります。理想的な状況で、サンプル濃度を倍増; として観察は信号倍増 (ピーク領域を使用して測定される)ただし、実習では、予測可能な方法を (例えば、線形フィット) で入力信号に比例して変化はプロテインの定量のために十分。さらに、この最適化はタンパク質濃度高信号ですがまだ実験的モデルの線形の範囲内を定義します。
3) 固定タンパク質濃度の最適化手順 2 で選択したを使用して最適な抗体濃度を決定します。抗体の濃度が増えると、それは彩度で高原まで信号が増加します。この飽和レベルに近い抗体濃度のタンパク質濃度の正確な測定に必要です。
ベアス-2B、気管支変形 SV 40 人間から分離された全細胞抽出物を用いたタンパク質濃度、抗体希釈液、自動キャピラリーによるサイズ測定6露出時間を最適化するために使用するプロセスを示す上皮細胞線。細胞や組織の抽出物からの蛋白質の隔離公開プロトコル7,8,9の数を使用して実行することができます、ここでは説明しません。最適化された条件を使用して実験の結果は合計の報告、リン酸化 1.2 にドキソルビシン (10細胞アポトーシスを誘導する一般的な化学療法剤) に公開される文化 (セリン 15、セリン 20) p53、1.8 と収穫前に h 4 の 2.4 μ g/mL メディア。P53 のピーク面積は、ɑ-チューブリン、ローディング コントロールとして使用する正規化されます。
何十年もがずっとあるキャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法の開発で持続的な関心低いサンプルと試薬の支出のため、減少処理従来の方法と比較して時間と高い互換性手順4,15を自動化します。毛細血管、ふるい分けの電気泳動、動電、ポリマーと (それぞれ異なるプロパティによってタンパク質を分離、等電点方法などを利用して蛋白質の分離のための異なるプロトコルの数があります。静電気、分配平衡、ふるい分け分離マトリックス、および pH のプロパティ)16。ここでは、自動化されている分離をふるい高分子を用いた抗体ベース (または免疫測定法) のキャピラリー電気泳動法と商業的に採用された3について述べる。このシステムの利点は、使用の操作、標準化された市販試薬と少ない試薬と西部のしみなど伝統的な蛋白質の試金と比較してサンプルを必要とする信頼性の高い、高感度測定の容易さ酵素免疫測定法、その他は、3,4,5を書式設定します。それは、利用可能な分離行列4、しかし最近の製品は 440 kda17 2 から測定可能な範囲を拡大しているによって評価することができます蛋白質のサイズの範囲が制限されており、この技術の以前の評価で指摘されています.さらに、いくつかの溶解バッファーは、18のアッセイに対応する知られている、したがって使用実験試薬の選択考慮されなければならない事前。
市販のコンポーネントを持つ自動化されたプロシージャの主な利点は、標準化された方法と試薬を使用して結果の一貫性です。これはプロシージャ内で重要なステップを自動化してアッセイの失敗のチャンスを最小化します。しかし、キャピラリー電気泳動を用いたイムノアッセイに関する問題を最小限に抑えるためのプロトコル間に特定の慣行が守られなければならないことに注意する重要です。まず、平板載荷の前に新鮮なすぐをルミノール-S/過酸化水素混合物準備は重要です。一貫したタイミングは、一貫性のある発光アッセイ後特定の抗体アッセイの一貫性のある測定値になります、酸化剤を追加した後で発生します。さらに、酸化剤の効力に影響を与える主に試薬の期限切れでないが使用されることが重要です。また、その他の試薬、抗体、サンプルの読み込み順序が (図 1参照) を従うこと厳密に重要です。場違い戻どの試薬は、アッセイの失敗と無駄な実行になります。
これらの重要な手順に加え手法で発生した主な問題は一般的に、最適化によって克服します。確かに、これらの条件はモデル システム/抗体の組み合わせごとに固有であり、したがって各の新しいアッセイの経験的決定する必要があります。この記事で私たちは 3 つの一般的な最適化の手順に焦点を当てる: 露光時間、ライセート滴定および一次抗体希釈。測定可能な結果を生成する能力は、いつルミノール基板はない急速に減らされて、信号の損失で基板の枯渇の結果として露光時間の解析に依存します。ライセートの滴定は、同じ蛋白質ターゲットのための異なった抗体と同様に、別のモデル システムと異なることがそれぞれのアッセイの線形ダイナミック レンジを決定します。抗体希釈濃度を飽和状態に近い選択は無料抗体の不足によって、利用できる蛋白質ターゲット エピトープの異なる量によってのみ、信号の変化は影響しないを確認します。抗体培養時間とスタッキング/サンプル読み込み時間最適化プロセス中にその他の考慮事項があります。ほとんどの場合は、楽器の既定の設定は、解像度と感度の最適なバランスを提供しています。ただし、いくつかの場合、貧しい人々 の解像度や感度を改善できますこれらのパラメーターを調整することによって。
キャピラリー電気泳動を用いた免疫測定法は、高速で効率的、かつ再現性のある蛋白質測定を提供します。一方、これらのメソッドは、研究・開発の設定で主に利用されている、これらの技術の一貫性は、規制と臨床アプリケーションの潜在的なユーティリティと。たとえば、病気の進行と環境毒性や患者に影響を受けやすい集団の同定は、血液、尿、唾液などのアクセス可能な行列の測定蛋白質バイオ マーカーに基づくことが。試薬と操作コスト ドロップ数のサンプルと同時に評価の増加をすることができますターゲットと多分キャピラリー電気泳動を用いたイムノアッセイ法アプリケーションのこれらの種類の使用を見る。
The authors have nothing to disclose.
著者は、研究と開発研究の三角形公園 (ORD RTP) グラフィックとメディア チーム開発のための米国環境保護庁テーピングし、教育のビデオの編集のキース tarpley 氏に感謝したいと思います。またデータ.の最適化に関する役に立つ会話の ProteinSimple からデボラ ・ プリチェットを感謝したいと思いますJM Guynn は、科学教育研究/参加プログラム米国の環境保護庁のオークリッジ国立研究所によって支えられました。
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |