모 세관 기반 immunoassay 상용 플랫폼을 사용 하 여 총 단백질 준비에서 대상 단백질을 측정 하는 보여 줍니다. 또한, 노출 시간, 단백질 농도, 및 항 체 희석의 분석 결과 매개 변수 셀 문화 모델 시스템 최적화 되어 있다.
모 세관 기반 immunoassays 활용 하는 새로운 기술이 전통적인 immunoassays에 비해 빠르고 더 정량적 단백질 평가 약속. 그러나, 유사한 다른 항 체 기반 단백질 분석 실험, 단백질 농도, 항 체 희석, 노출 시간 등의 모 세관 기반 immunoassay 매개 변수의 최적화는 의미 있고 신뢰할 수 있는 생성에 중요 한 전제 조건 데이터입니다. 측정 신호에 변화는 변화 lysate 농도에 직접 비례 분석 결과의 선형 범위 내에서을 해야 합니다. BEAS-2B, 인간 기관지 상피 세포 라인에 적절 한 lysate 농도, 항 체 희석, 및 노출 시간을 선택 하는 과정은 여기에 설명 했다. 분석 결과 선형성 p53 및 α-tubulin 항 체와 전체 셀 추출 단백질 농도의 범위 표시 됩니다. 긴 노출 시간, 최고 농도에서 볼 신호 소진의 예 고는 α-tubulin 항 체 희석 곡선 채도 보여주는 표시 됩니다. 또한, 실험 결과 예 최적화 된 매개 변수를 사용 하 여 독 소 루비 치료 셀에 대 한 보고 됩니다.
모 세관 전기 이동 immunoassays 크기 또는 충전 분리 시스템을 사용 하 여 세포 lysates의 단백질 발현을 측정 하 고 전통적인 immunoassays 이상의 몇 가지 장점을 제공. 예를 들어 자동화 된 모 세관 기반 프로시저 젤, 전송 장치, 필요 없다 서쪽 오 점에 비해, 그리고 수동 세척. 또한, 필요한 단백질의 절대 금액은 약 10 배, 모 세관 기반 시스템 희귀 세포 유형 또는 제한 된 샘플1,2와 함께 사용 하기 위해 이상적. 결과 자동화 된 시스템을 사용 하 여 3 h 만큼 적게 하 고 이전 보다 양적 하 고 기존의 서양 보다 재현할 수 입증 되었습니다 절차3,,45오 점. 크기 기반 분석에 대 한 프로세스 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), dithiothreitol (DTT)를 포함 하는 샘플을 로드 이루어져 붙일 분리 및 매트릭스를 포함 하는 모 세관 컬럼으로 분자량 마커를 표시. 모세 혈관에 적용 하는 전압 크기, 견본에서 단백질 분리 그리고 자외선 움직이게 모 세관 벽에 분리 된 단백질. 모 세관은 다음 특정 대상 1 차 항 체와 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 면역 조사-활용 된 이차 항 체. Luminol 그리고 과산화 수소 촉매 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라에 의해 측정 하 고 단백질을 quantitate 분석 chemiluminescent 가벼운 발생.
단백질 농도, 항 체 희석, 노출 시간 등 분석 결과 조건의 최적화 상대적 용이성 및 자동화 된 모 세관 기반 전기 이동 immunoassay 플랫폼의 속도도 불구 하 고 정확 하 고 재현성을 얻기 위해 중요 하다 결과입니다. 일반적으로, 이러한 시스템에 대 한 분석 결과 최적화 하기 위해 다음 절차를 수행 합니다.
화면 1)을 평가 하 고 신호 및 특이성 단백질 대상에 대 한 항 체를 선택 수행 되어야 한다. 가능한 경우, 순화 된 단백질 또는 대상 epitope 특이성;을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 아직도 모델 시스템에서 공급 하는 총 단백질의 잠재적인 일반적인 신호 들을 평가 하는 것이 중요입니다.
2) 다음, 분석 결과의 동적 범위는 결정 될 필요가 있다. 이상적인 상황에서 신호 배로 (피크 영역을 사용 하 여 측정)는 관찰 샘플 농도 두배로 된다; 그러나, 실제로, 예측 가능한 방식으로 (예를 들어, 선형 적합) 입력 신호에 비례 변화는 단백질 정량화에 대 한 충분 한. 또한,이 최적화는 단백질 농도 높은 신호 하지만 여전히 실험 모델에 대 한 선형 범위 내에서 정의 합니다.
3) 최적화 단계 2에서에서 선택한 고정된 단백질 농도 사용 하 여 최적의 항 체 농도 결정 합니다. 항 체 농도 증가, 신호 채도에서 정점까지 증가 한다. 이 채도 레벨 항 체 농도 단백질 농도의 정확한 측정을 위해 필요 합니다.
단백질 농도, 항 체 희석, 및 자동화 된 모 세관 기반 크기 분석 결과6 에 대 한 노출 시간을 최적화 하는 데 사용 하는 프로세스는 전체 셀 추출 BEAS-2B의 기관지는 SV 40 변형 인간에서 격리를 사용 하 여 보여 줍니다. 상피 세포 라인입니다. 셀 또는 조직 추출에서 단백질 격리 게시 프로토콜7,,89 의 숫자를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 여기 적용 되지 않습니다. 최적화 된 조건을 사용 하 여 시험 실험의 결과 또한 총에 대 한 보고 및 phosphorylated 1.2, 독 소 루비 (일반적인 화학요법 에이전트 유도 세포 apoptosis10)에 노출 하는 문화에서 (15, 20 떠들고 떠들고) p53 1.8, 그리고 2.4 µ g/mL 미디어 수확 전에 h 4에 대 한. P53 피크 넓이에 ɑ-tubulin, 로드 제어로 사용 되는 정규화 됩니다.
수십 년 동안, 계속 있다 모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 방법의 개발에 지속적인된 관심 비용 때문에 낮은 샘플 및 시 약, 감소 처리 전통적인 방법에 비해 시간과 높은 호환성 절차4,15를 자동화 합니다. 모 세관 전기 이동, electrokinetic, 폴리머 체질, 및 (각각 다른 속성에 의해 단백질 분리, 전자 방법 등을 활용 하는 단백질의 분리에 대 한 서로 다른 프로토콜의 수가 있다 정전기, 파티션 평형, 체질 분리 행렬 및 pH의 속성)16. 여기, 우리는 체질 분리, 자동화 된 폴리머를 사용 하 여 항 체 (또는 immunoassay) 모 세관 전기 이동 법 방법 및 상업적으로 채택된3설명 합니다. 이 시스템의 장점은 사용 및 운영, 표준화 및 상용 시 약 및 시 약 및 샘플 서쪽 오 점, 같은 전통적인 단백질 분석 실험에 비해 덜 요구 하는 안정적이 고 민감한 측정의 용이성을 포함 효소 연결 된 immunoassay 그리고 다른3,,45형식. 그러나 그것은 지적 하고있다이 기술 이전 평가에서 평가 될 수 있다 단백질의 크기 범위는 사용 가능한 분리 매트릭스4, 최근 제품 440 kDa17 2에서 측정 범위 확대에 의해 제한 되어 . 또한, 일부 lysate 버퍼 분석 결과18과 호환 되도록 알려져 있다, 따라서 실험 시 약 사용의 선택을 고려해 야 합니다 미리.
상업적으로 사용할 수 있는 구성 요소와 자동화 된 절차의 주요 장점은 표준화 된 방법 및 시 약을 통해 결과의 일관성입니다. 이 프로시저 내에서 중요 한 단계를 자동화 하 여 시험 실패의 가능성을 최소화 합니다. 그러나, 그것은 모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 문제를 최소화 하기 위해 프로토콜 중 특정 관행을 준수 해야 합니다는 것을 주의 하는 것이 중요. 첫째, 그것은 중요 하 luminol-S/과산화 수소 혼합물 준비 신선 하 고 즉시 플레이트 로드 하기 전에입니다. 산화 제 추가 분석 결과 후 특정 항 체 분석 결과 대 한 일관 된 측정 결과 일관 된 타이밍 일관 된 발광 높아집니다. 또한,는 주로 산화 에이전트의 힘에 영향을 미치는 만료 되지 않은 시 약 사용 되는 중요 하다. 또한, 그 샘플, 항 체, 및 다른 시 약의 로드 순서 엄격 하 게 따라 ( 그림 1참조) 중요 하다. 모든 시 약 장소 pipetted 분석 결과 실패와 낭비 실행 발생 합니다.
이러한 중요 한 단계 외 기법으로 기본 문제 일반적으로 최적화를 통해 극복할 수 있습니다. 사실, 이러한 조건을 각 모델 시스템/항 체 결합 하 고 그러므로 각 새로운 분석 결과 대 한 경험적으로 결정 한다. 이 문서에서는, 우리는 세 가지 일반적인 최적화 절차에 초점: 노출 시간, lysate 적정 및 1 차적인 항 체 희석. 측정 결과 생성 하는 기능 때 luminol 기질 하지 되 고 급속 하 게 고갈, 신호 손실에 기판 고갈 결과 노출 시간 분석에 따라 달라 집니다. Lysate 적정도 동일한 단백질 대상에 대 한 다른 항 체로 서 다른 모델 시스템, 다 수 각 분석 결과의 선형 동적 범위를 결정 합니다. 항 체 희석 또는 포화 농도 근처 선택 신호에 변화 것입니다 영향을 받지 않을 무료 항 체의 부족 하지만 서로 다른 양의 사용 가능한 단백질 대상 epitope에 의해서만 확인 합니다. 항 체 외피 시간과 스태킹/샘플 로딩 시간 최적화 과정에서 다른 고려 사항이 포함할 수 있습니다. 대부분의 경우 악기에 대 한 기본 설정에서에서 해상도 감도의 좋은 균형을 제공 합니다. 그러나, 경우에 따라 가난한 해상도나 감도 개선할 수 있습니다 이러한 매개 변수를 조정 하 여.
모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 메서드는 빠르고, 효율적, 재현할 수 단백질 측정을 제공합니다. 이러한 방법을 연구 및 개발에서 주로 이용 되었습니다, 이러한 기술의 일관성 규제 및 임상 응용 프로그램에 잠재적인 유틸리티가 있다. 예를 들어 질병의 진행과 환경 유독 또는 환자 취약 부분 모집단의 식별 액세스할 수 행렬, 혈액, 소변, 타 액 등에서 측정 단백질 바이오 마커 기반 될 수 있습니다. 시 약 및 작업 비용 드롭 샘플 및 평가 동시에 증가 될 수 있는 대상의 수, 우리가 가능성이 이러한 종류의 응용 프로그램에 사용 되는 모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 방법 볼 것 이다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 키스 Tarpley는 미국 EPA 사무실의 개발을 위한 연구와 개발-연구 삼각형 공원 (RTP 오드) 그래픽 및 미디어 팀의 녹화, 그리고 교육용 비디오의 편집을 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 우리의 데이터. 의 최적화에 관한 유용한 대화에 대 한 ProteinSimple에서 데보라 Pritchett를 감사 하 고 싶습니다. JM Guynn 했다 오크 리 지 연구소 과학 및 미국 환경 보호국에서 교육 연구/참여 프로그램에 지원 됩니다.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |