Summary

Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de<em> Vibrio cholerae</em> Isolados clínicos e ambientais

Published: May 30, 2017
doi:

Summary

Este manuscrito descreve as técnicas adequadas de manutenção de Vibrio cholerae , além de uma série de ensaios bioquímicos, utilizados coletivamente para a diferenciação rápida e confiável entre a V clínica e ambiental. Biótipos de cholerae em um ambiente de laboratório.

Abstract

A bactéria aquática Gram-negativa Vibrio cholerae é o agente etiológico da doença gastrointestinal infecciosa cólera. Devido à prevalência global e à gravidade desta doença, V. Cholerae tem sido amplamente estudado em ambientes ambientais e laboratoriais, exigindo técnicas adequadas de manutenção e cultura. Classical e El Tor são dois biótipos principais que compõem o V. Serogrupo de cholerae O1, cada um apresentando características genotípicas e fenotípicas únicas que fornecem mecanismos confiáveis ​​para a caracterização de biótipos e requerem indução de condições de cultivo que induzem a virulência. Independentemente do biótipo da tensão causadora para qualquer infecção ou surto, o tratamento padrão para a doença envolve a terapia de reidratação suplementada com um regime de antibióticos. No entanto, a classificação do biótipo pode ser necessária para estudos laboratoriais e pode ter impactos mais amplos no campo biomédico.No início de 2000, foram identificados isolados clínicos que exibem traços genotípicos e fenotípicos de biótipos clássicos e El Tor. Os híbridos recentemente identificados, denominados variantes de El Tor, fizeram com que a identificação de biótodos isolados clínicos e ambientais se tornasse mais complexa do que os protocolos tradicionais de identificação de ensaio simples. Além de descrever V. Técnicas de manutenção e cultura geral de cholerae , este manuscrito descreve uma série de ecrãs genéticas baseadas em PCR específicas para genes ( ctxB e tcpA ) e testes fenotípicos (resistência a polimixina B, metabolismo de citrato, atividade proteolítica, atividade hemolítica, motilidade e metabolismo de glicose através de Voges- Ensaio Proskauer) usado coletivamente para caracterizar e / ou distinguir entre biótipos clássicos e El Tor. Juntos, esses ensaios fornecem uma abordagem sistemática eficiente para ser usada como alternativa ou, além disso, em experiências caras e intensivas em mão-de-obra na caracterizaçãoÇão de V. Isolados clínicos (e ambientais) de cholerae .

Introduction

A cólera é uma doença do intestino delgado distal causada pelo consumo de alimentos contaminados ou água contendo a bactéria Gram-negativa Vibrio cholerae aquática. Os sintomas da cólera incluem vômitos e diarréia aquosa incontrolável, levando a desidratação severa, que, se não for tratada adequadamente, resultará em morte. V. Cholerae pode ser dividido em mais de 200 serogrupos com base na estrutura do antígeno O de lipopolissacarídeo de superfície celular. No entanto, apenas 2 sorogrupos, O1 e O139, mostraram potencial epidêmico ou pandêmico 1 , 2 . Além disso, o serogrupo O139 foi isolado principalmente no Sudeste Asiático 3 , 4 , enquanto o serogrupo O1 está distribuído em todo o mundo. Além disso, o sorogrupo O1 pode ser dividido em 2 biótipos principais: clássico e El Tor. O biótipo clássico foi responsável pela primeira pandemia de cólera 6Entre 1817 e 1923. A sétima pandemia em curso é resultado do biótipo El Tor, que deslocou globalmente o biótipo clássico no ambiente 5 , 6 , 7 . Recentemente, surgiram tensões que contêm características distintivas dos biótipos clássicos e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e desde então foram denominadas variantes 13 , 17 de El Tor. Algumas variantes de El Tor demonstraram capacidades de virulência elevadas com progressão de doença mais rápida e grave do que a observada anteriormente, enfatizandoA necessidade de uma abordagem mais abrangente para identificação de agentes e prevenção e tratamento de doenças 8 , 9 , 18 . Embora a identificação do biótipo não dê de imediato o tratamento, os avanços no desenvolvimento da vacina e nos futuros agentes terapêuticos podem beneficiar da distinção biótipo.

A primeira série de protocolos listados aqui permitirá que os investigadores mantenham corretamente V. Cepas de cólera em um ambiente de laboratório. Consistência e análise subseqüente requerem a preparação de estoque e o crescimento de isolados, o que não é biótipo-dependente. No entanto, para induzir de forma otimizada a expressão de genes de virulência, são necessárias técnicas de cultura de bioótipo independentes 19 . Além disso, a preparação para vários ensaios genéticos e bioquímicos é descrita neste manuscrito.

A toxina da cólera (CT) e a toxina co-rePilula gulosa (TCP) são dois principais fatores de virulência controlados pelo regulador mestre ToxT em ambos biótipos do V. Serogrupo 20 de cholerae O1. CT é uma toxina bipartida composta por cinco CtxB Subunidades envolvendo uma única subunidade CtxA, e é responsável pela perda rápida de eletrólito associada à cólera. TCP é um pilus tipo IV codificado pelo operão tcp ( tcpABQCRDSTEF ), e está envolvido na fixação e colonização do intestino delgado distal. TcpA é o primeiro gene do operão tcp que codifica as subunidades individuais de pilina essenciais para a construção do pilus 8 . A sequência de genes para ctxA é completamente conservada entre biótipos clássicos e El Tor, enquanto ctxB e tcpA diferem entre os dois biótipos, mas são conservados dentro de cada biótipo 8 . CtxB é completamente conservado entre biótipos, exceto em dois pontos básicos(115 e 203). No biótipo de El Tor, a timina reside nas posições de base 115 e 203, enquanto o biótipo clássico contém citosina nestas bases. TcpA é completamente conservado dentro de cada biótipo, mas diferem em bases múltiplas entre biótipos. Essas distinções genéticas servem como marcadores primários de identificação de biótipo e, depois de seqüenciar o produto de amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), incluindo esses locais, as seqüências isoladas podem ser comparadas com O395 ou WT El Tor N16961 de tipo selvagem (WT) para determinar o fundo do biótipo De CT e TCP, respectivamente, em um isolado de V. cholerae .

Numerosos protocolos foram desenvolvidos para caracterizar as distinções fenotípicas entre os biótipos clássicos e El Tor 21 , 22 , 23 . A polimixina B é um antibiótico peptídico que compromete a integridade da membrana celular externa em bactérias Gram-negativasE a resistência à polimixina B podem ser visualizadas através do ensaio de resistência à polimixina B 21 . O citrato é um substrato primário do ciclo do Kreb e a capacidade de metabolizar o citrato como única fonte de carbono pode ser determinada utilizando o ensaio de metabolismo de citrato 22 . HapR codifica um regulador global e o regulador mestre de sensor de quorum em V. cholerae, HapR, que se liga a várias regiões promotoras e regula a expressão de genes e operões 24 . Algumas cepas patogênicas de V. cholerae têm uma mutação de mudança de quadro natural no gene hapR que causou a perda da densidade da expressão de genes da virulência 24 , 25 . Medir a atividade de protease regulada por HapR usando meios de agar de leite permite ao pesquisador identificar se um isolado particular contém um HapR 23 funcional. oTestes de análise de hemólise para a capacidade de uma cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisam glóbulos vermelhos; O grau de hemólise pode ser visualizado em placas de agar de sangue 23 . A mobilidade é freqüentemente associada à virulência em V. cholerae e pode ser analisada usando placas de ágar de motilidade 23 . O teste de Voges-Proskauer prova a capacidade de uma cepa para fermentar a glicose como única fonte de carbono e produzir o acetato de subproduto 21 . Com o surgimento de variantes de El Tor, é difícil prever os resultados de qualquer teste fenotípico dado sem rastreio genotípico extensivo e antes de deduzir o fundo biótipo de V. Isolados de cholerae , recomenda-se a realização desta montagem de ensaios 23 e compare os resultados com as cepas de referência como na Tabela 2 .

Aqui, avançamos uma série de protocolos, utilizando coletivamente o referidoEnsaios fenotípicos e fenotípicos referentes a uma abordagem mais abrangente para a caracterização de V. Biótipos de cólera . Além disso, descrevemos as distinções genotípicas e fenotípicas do V conhecido. Variantes de cholerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), em comparação com as estirpes de referência de biótopos comummente usadas (WT clássico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabela 1 ). O surgimento de variantes de El Tor apresentou desafios à confiabilidade de protocolos de caracterização de bióto simples de ensaio previamente empregados; No entanto, este sistema de identificação de múltiplos ensaios permitirá uma caracterização mais confiável do V clínico e ambiental. Isolados de cólera .

Protocol

Nota: As considerações de tempo para cada ensaio devem ser feitas uma vez que as preparações de mídia individuais exigem tempos diferentes. Por exemplo, meios sólidos de placas de ágar devem ser deixados suficientemente arrefecer e secar (1-2 dias). Considerações de tempo adicionais ( isto é, colônia única e crescimento da cultura durante a noite) são especificadas em cada protocolo e são encontradas na Tabela 2 . 1. Preparação de mídia <…

Representative Results

Para uma manutenção e uso adequados de qualquer tensão bacteriana, recomenda-se conhecer o tempo de duplicação da (s) tensão (ões) de interesse. Aqui, as taxas de crescimento variáveis ​​dos V comummente utilizados . As cepas de colesterol foram demonstradas através de uma curva de crescimento, e tempos de duplicação aproximados foram calculados usando regressão linear. WT El Tor N16961 e a variante El Tor MQ1795 demonstraram tempos de duplicaç…

Discussion

Dos mais de 200 V identificados. Sorogrupos de colesterol, apenas O1 e O139 têm potencial de epidemia. O serogrupo O1 pode ser dividido em dois biótipos: clássico e El Tor. No entanto, emergiram as variedades híbridas, denominadas Variantes 13 , 17 de El Tor , que possuem o fundo do biótipo El Tor e apresentam características clássicas 8 , 9 , 10</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Pesquisa apoiada por New Hampshire-INBRE através de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA), P20GM103506, do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH.

Materials

1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% Glycerol Calbiochem 356352 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352
Agar Becto, Dickinson and Co. 214030 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agar with brain-heart infusion Becto, Dickinson and Co. 237500 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agarose Peqlab 732-2789 https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anhydrous K2HPO4 Fisher Scientific P288-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Blood Agar Plates Remel R01200 Store at 4 °C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Boric Acid Fisher Scientific A73-500 https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol Blue Fisher Scientific B388-10 https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Cirtric acid ·H2O Fisher Scientific S72836-3 https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit New England Biolabs N0446S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTA Fisher Scientific S311-500 https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit Zymo Research D4007 http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Nucleic Acid Stain Biotium 41005 https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer Thermo Scientific 840-208100 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit Qiagen 158567 https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HCl Fisher Scientific A144-212 Corrosive;  https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
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KOH Fisher Scientific P250-500 https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le Loop Decon Labs Inc. MP190-25 http://deconlabs.com/products/leloop/
Le Stab Decon Labs Inc. MP186-5 http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4·7H2O Fisher Scientific M63-500 https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
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Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
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NanoDrop Lite Spectrophtometer Thermo Scientific ND-LITE-PR https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Nonfat dry milk Nestle Carnation N/A N/A
Peptone Becto, Dickinson and Co. 211677 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Petri Dishes (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
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Polymyxin B sulfate salt Sigma-Aldrich P1004-10MU Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US
Taq DNA Polymerase New England Biolabs M0273S Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Reaction Buffer New England Biolabs M0273S Store at -20 °C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™  Bio Rad Labs 1840148 http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Triphenyltetrazolium chloride Alfa Aesar A10870 https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
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Tryptone Becto, Dickinson and Co. 211705 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Yeast Extract Becto, Dickinson and Co. 212750 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
α-napthol MP Biomedicals 204189 http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189

References

  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
  5. Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

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Cite This Article
Brumfield, K. D., Carignan, B. M., Ray, J. N., Jumpre, P. E., Son, M. S. Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates. J. Vis. Exp. (123), e55760, doi:10.3791/55760 (2017).

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