Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em> Vibrio cholerae</em> Klinische und umweltliche Isolate
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich.
Abstract
Das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae ist der ätiologische Wirkstoff der infektiösen Magen-Darm-Cholera. Wegen der globalen Prävalenz und Schwere dieser Krankheit, V. Cholerae wurde sowohl im Umwelt- als auch im Laborbereich umfassend untersucht und erfordert eine ordnungsgemäße Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken. Klassik und El Tor sind zwei Hauptbiotypen, die das V bilden . Cholerae O1 Serogruppe, die jeweils einzigartige genotypische und phänotypische Eigenschaften aufweisen, die zuverlässige Mechanismen für die Biotypcharakterisierung liefern und unterschiedliche Virulenz induzierende Kultivierungsbedingungen erfordern. Unabhängig von der Biotype des ursächlichen Stammes für jede gegebene Infektion oder Ausbruch, die Standard-Behandlung für die Krankheit beinhaltet Rehydratationstherapie ergänzt mit einem Regime von Antibiotika. Allerdings kann eine Biotyp-Klassifikation für Laboruntersuchungen erforderlich sein und kann im biomedizinischen Bereich breitere Auswirkungen haben.In den frühen 2000er Jahren wurden klinische Isolate identifiziert, die genotypische und phänotypische Merkmale sowohl von klassischen als auch von El Tor Biotypen aufweisen. Die neu identifizierten Hybriden, die als El Tor-Varianten bezeichnet wurden, haben dazu geführt, dass die klinische und ökologisch isolierte Biotypidentifikation komplexer wird als die bisherigen traditionellen Einzelassay-Identifikationsprotokolle. Neben der Beschreibung von V. Cholerae-Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken beschreibt dieses Manuskript eine Reihe von gen- spezifischen ( ctxB- und tcpA ) PCR-basierten genetischen Bildschirmen und phänotypischen Assays (Polymyxin B-Resistenz, Citrat-Metabolismus, proteolytische Aktivität, hämolytische Aktivität, Motilität und Glukosestoffwechsel über Voges- Proskauer-Assay), der gemeinsam zur Charakterisierung und / oder Unterscheidung zwischen klassischen und El-Tor-Biotypen verwendet wird. Gemeinsam bieten diese Assays einen effizienten systematischen Ansatz als Alternative oder zusätzlich zu kostspieligen, arbeitsintensiven Experimenten in der CharakteristikVon V. Cholerae klinische (und umwelt-) isolate.
Introduction
Cholera ist eine Erkrankung des distalen Dünndarms, die durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser verursacht wird, die das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae enthalten. Symptome der Cholera sind Erbrechen und unkontrollierbare wässrige Durchfall, was zu schweren Dehydratation, die, wenn nicht richtig behandelt, wird zum Tod führen. V. Cholerae können in über 200 Serogruppen aufgeteilt werden, basierend auf der Struktur des Zelloberflächen-Lipopolysaccharids O-Antigens. Allerdings haben nur 2 Serogruppen, O1 und O139, epidemisches oder pandemisches Potential 1 , 2 gezeigt . Darüber hinaus ist die Serogruppe O139 in erster Linie nach Südostasien 3 , 4 isoliert, während die Serogruppe O1 weltweit verteilt ist. Darüber hinaus kann die O1-Serogruppe in 2 Haupt-Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Der klassische Biotyp war für die erste 6 Cholera-Pandemie verantwortlichS zwischen 1817 und 1923. Die laufende siebte Pandemie ist ein Ergebnis des El Tor Biotyps, der weltweit den klassischen Biotyp in der Umwelt 5 , 6 , 7 vertrieben hat . In letzter Zeit sind Stämme aufgetreten, die charakteristische Merkmale sowohl der klassischen als auch der El Tor-Biotypen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 enthalten und seither als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden . Einige El Tor-Varianten haben erhöhte Virulenz-Fähigkeiten mit einer schnelleren und schweren Krankheitsprogression gezeigt als bisher beobachtet, betontDie Notwendigkeit eines umfassenderen Ansatzes zur Identifizierung von Mitteln und zur Vorbeugung von Krankheiten 8 , 9 , 18 . Während die Biotyp-Identifizierung nicht sofort die Behandlung diktiert, können weitere Fortschritte in der Impfstoffentwicklung und zukünftigen therapeutischen Mitteln von der Biotypunterscheidung profitieren.
Die erste Reihe von Protokollen, die hier aufgelistet sind, ermöglicht es den Ermittlern, V richtig zu pflegen. Cholerae-Stämme im Laborbereich. Konsistenz und anschließende Analyse erfordert die Vorbereitung und das Wachstum von Isolaten, die nicht biotypabhängig sind. Um jedoch die Virulenzgenexpression optimal zu induzieren, sind unabhängige biotypspezifische Kultivierungstechniken erforderlich. Darüber hinaus ist die Vorbereitung für verschiedene genetische und biochemische Assays in diesem Manuskript skizziert.
Cholera-Toxin (CT) und das Toxin co-reGulf Pilot (TCP) sind zwei Hauptvirulenzfaktoren, die vom Masterregler ToxT in beiden Biotypen des V gesteuert werden. Cholerae O1 serogruppe 20 CT ist ein bipartites Toxin aus fünf CtxB Untereinheiten, die eine einzelne CtxA-Untereinheit umgeben, und ist verantwortlich für den schnellen Elektrolytverlust, der mit Cholera verbunden ist. TCP ist ein Typ-IV-Pilus, der von dem tcp- Operon ( tcpABQCRDSTEF ) codiert wird, und ist an der Anhaftung und Besiedlung des distalen Dünndarms beteiligt. TcpA ist das erste Gen des tcp- Operons, das für die einzelnen Pilinuntereinheiten kodiert, die für den Bau des Pilus 8 wesentlich sind. Die Gensequenz für ctxA ist vollständig zwischen klassischen und El Tor Biotypen konserviert , während ctxB und tcpA sich über die beiden Biotypen unterscheiden, aber in jedem Biotyp 8 konserviert sind. CtxB ist vollständig zwischen Biotypen außer bei zwei Base posi konserviert(115 und 203). Im El-Tor-Biotyp befindet sich Thymin an den Basenpositionen 115 und 203, während der klassische Biotyp an diesen Basen Cytosin enthält. TcpA ist in jedem Biotyp vollständig konserviert, unterscheidet sich aber bei mehreren Basen zwischen Biotypen. Diese genetischen Unterscheidungen dienen als primäre Biotyp-Identifikationsmarker, und nach der Sequenzierung des Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Amplifikationsprodukts einschließlich dieser Stellen können Isolationssequenzen mit Wildtyp (WT) klassischem O395 oder WT El Tor N16961 verglichen werden, um den Biotyphintergrund zu bestimmen Von CT und TCP in einem gegebenen V. cholerae- Isolat.
Es wurden zahlreiche Protokolle entwickelt, um die phänotypischen Unterscheidungen zwischen den klassischen und den El Tor Biotypen 21 , 22 , 23 zu charakterisieren. Polymyxin B ist ein Peptid-Antibiotikum, das die Integrität der äußeren Zellmembran im Gram-negativen bac kompromittiertTeria und Polymyxin B-Resistenz können durch den Polymyxin-B-Resistenz-Assay 21 sichtbar gemacht werden. Citrat ist ein primäres Substrat des Kreb-Zyklus, und die Fähigkeit, Citrat als einzige Kohlenstoffquelle zu metabolisieren, kann unter Verwendung des Citratmetabolismus-Assays 22 bestimmt werden . HapR kodiert einen globalen regulator und den master quorum-sensing regulator in V. cholerae, HapR, der an verschiedene Promotorregionen bindet und die Gen- und Operon-Expression 24 reguliert. Einige pathogene Stämme von V. cholerae haben eine natürlich vorkommende Frame-Shift-Mutation im hapR- Gen, die diese dichteabhängige Regulation der Virulenzgenexpression verursacht hat, um 24 , 25 verloren zu werden. Die Messung der HapR-regulierten Protease-Aktivität unter Verwendung von Milch-Agar-Medien ermöglicht es dem Forscher zu identifizieren, ob ein bestimmtes Isolat eine funktionelle HapR 23 enthält . DasHämolyse-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, hämolytische Enzyme zu sezernieren, die rote Blutkörperchen lysieren; Der Grad der Hämolyse kann auf Blut-Agarplatten 23 sichtbar gemacht werden. Die Motilität ist oft mit der Virulenz in V. cholerae assoziiert und kann mit Motilitäts-Agarplatten 23 analysiert werden. Die Voges-Proskauer-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, Glukose als einzige Kohlenstoffquelle zu gären und das Nebenprodukt Acetoin zu produzieren 21 . Mit der Entstehung von El Tor-Varianten ist es schwierig, die Ergebnisse eines gegebenen phänotypischen Assays ohne umfangreiches genotypisches Screening vorherzusagen und vor dem Ableiten des Biotyp-Hintergrunds von V. Cholerae-Isolate ist es empfehlenswert, diese Assemblierung von Assays 23 durchzuführen und die Ergebnisse mit Referenzstämmen wie in Tabelle 2 zu vergleichen.
Hier haben wir eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die gemeinsam den Vorläufer nutzenGenotypische und phänotypische Assays für einen umfassenderen Ansatz zur Charakterisierung von V. Cholerae biotypen Darüber hinaus haben wir die genotypischen und phänotypischen Unterscheidungen der bekannten V beschrieben. Cholerae El Tor-Varianten (MQ1795 und BAA-2163) im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Biotyp-Referenzstämmen (WT-Klassik O395, WT El Tor C6706 und WT El Tor N16961, Tabelle 1 ). Die Entstehung von El Tor-Varianten hat Herausforderungen für die Zuverlässigkeit von zuvor eingesetzten Single-Assay-Biotyp-Charakterisierungsprotokollen herausgestellt; Dieses Mehrfach-Assay-Identifizierungssystem wird jedoch eine zuverlässigere Charakterisierung von klinischen und ökologischen V ermöglichen. Cholerae isoliert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Von den über 200 identifizierten V. Cholerae Serogruppen, nur O1 und O139 haben epidemisches Potential. Die O1 Serogruppe kann in zwei Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Allerdings sind Hybrid-Stämme, die als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden, entstanden, die den El-Tor-Biotyp-Hintergrund besitzen und klassische Merkmale 8 , 9 , 10 <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung unterstützt von New Hampshire-INBRE durch einen Institutional Development Award (IDeA), P20GM103506, vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften des NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Anhydrous K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Blood Agar Plates | Remel | R01200 | Store at 4 °C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromothymol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Cirtric acid ·H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
| HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Corrosive; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4·7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
| MR-VP Broth | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
| NaNH4HPO4·4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
| Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Petri Dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Petri Dishes (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Reaction Buffer | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Triphenyltetrazolium chloride | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Tris∙HCl | Calbiochem | 9310 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride—CAS-1185-53-1—Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP |
| Tryptone | Becto, Dickinson and Co. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Yeast Extract | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
References
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
- Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
- Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
- Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
- Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
- Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
- Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
- Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
- Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
- Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
- Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
- Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
- Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
- Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
- Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
- Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
- Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
- Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
- DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
- Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
- Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
- Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
- Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
- Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).
