Laboratoriumtechnieken die gebruikt worden om biotypes van te houden en te onderscheiden<em> Vibrio cholerae</em> Klinische en milieu-isolaten
Summary
Dit manuscript beschrijft de juiste Vibrio cholerae onderhoudstechnieken naast een reeks biochemische analyses, collectief gebruikt voor snelle en betrouwbare differentiatie tussen klinische en milieuvriendelijke V. Cholerae biotypen in een laboratorium omgeving.
Abstract
De aquatische Gram-negatieve bacterie Vibrio cholerae is het etiologische middel van de infectieuze gastro-intestinale ziekte cholera. Vanwege de wereldwijde prevalentie en ernst van deze ziekte, V. Cholerae is uitgebreid bestudeerd in zowel milieu- als laboratoriuminstellingen, waarbij de juiste onderhouds- en cultuurtechnieken nodig zijn. Klassieke en El Tor zijn twee hoofdbiotypes die de V componeren. Cholerae O1 serogroep, die elk unieke genotypische en fenotypische eigenschappen tonen die betrouwbare mechanismen voor biotype karakterisering verschaffen, en vereisen duidelijke virulentie-inducerende kweekomstandigheden. Ongeacht het biotype van de causatieve stam voor een gegeven infectie of uitbraak, omvat de standaardbehandeling voor de ziekte rehydratietherapie, aangevuld met een antibiotica regime. Biotype classificatie kan echter nodig zijn voor laboratoriumstudies en kunnen bredere effecten hebben op het biomedische gebied.In het begin van 2000 werden klinische isolaten geïdentificeerd die genotypische en fenotypische eigenschappen uit zowel klassieke als El Tor-biotypes vertoonden. De nieuw geïdentificeerde hybriden, aangeduid als El Tor varianten, hebben de biotype-identificatie van klinische en milieu-isolatie complexer geworden dan eerdere traditionele identiteitsprotocollen met een enkelvoudige test. Naast het omschrijven van V. Cholerae algemene onderhouds- en cultuurtechnieken beschrijft dit manuscript een reeks genspecifieke ( ctxB en tcpA ) PCR gebaseerde genetische schermen en fenotypische analyses (polymyxine B resistentie, citraat metabolisme, proteolytische activiteit, hemolytische activiteit, motiliteit en glucose metabolisme via Voges- Proskauer assay) collectief gebruikt om te karakteriseren en / of te onderscheiden tussen klassieke en El Tor biotypes. Samen vormen deze analyses een efficiënte systematische aanpak die als alternatief kan worden gebruikt, of bovendien dure, arbeidsintensieve experimenten in de characterizaVerdeling van V. Cholerae klinische (en milieu) isolaten.
Introduction
Cholera is een ziekte van de distale dunne darm, veroorzaakt door de consumptie van verontreinigd voedsel of water dat de aquatische Gram-negatieve bacterie Vibrio cholerae bevat . Symptomen van cholera omvatten braken en onbeheersbare waterige diarree, wat leidt tot ernstige uitdroging, die, indien niet goed behandeld, tot de dood zal leiden. V. Cholerae kan worden verdeeld in meer dan 200 serogroepen op basis van de structuur van het lipopolysaccharide O-antigen van het celoppervlak. Echter, slechts 2 serogroepen, O1 en O139, hebben epidemie of pandemische potentieel 1 , 2 getoond. Bovendien is serogroep O139 voornamelijk geïsoleerd voor Zuidoost-Azië 3 , 4 , terwijl serogroep O1 wereldwijd wordt verspreid. Bovendien kan de O1 serogroep worden verdeeld in 2 hoofdbiotypes: klassiek en El Tor. Het klassieke biotype was verantwoordelijk voor de eerste 6 cholera pandemieS tussen 1817 en 1923. De lopende zevende pandemie is een gevolg van het El Tor biotype, dat het klassieke biotype wereldwijd in de omgeving 5 , 6 , 7 heeft verplaatst. Recent zijn er stammen ontstaan die onderscheidende kenmerken bevatten van zowel klassieke als El Tor biotypen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 en zijn sindsdien El Tor varianten 13 , 17 genoemd . Sommige El Tor varianten hebben verhoogde virulentiecapaciteiten aangetoond met een snellere en ernstige ziekteprogressie dan eerder waargenomen, onderstrepenDe behoefte aan een meer omvattende aanpak van agentidentificatie en preventie en behandeling van ziekte 8 , 9 , 18 . Terwijl de identificatie van biotype de behandeling niet onmiddellijk dicteert, kunnen verdere ontwikkelingen in vaccinontwikkeling en toekomstige therapeutische middelen profiteren van biotype onderscheid.
De eerste reeks protocollen die hier worden vermeld, zullen de onderzoekers in staat stellen V te behouden. Cholerae stammen in een laboratorium omgeving. Consistentie en daaropvolgende analyse vereist voorraadbereiding en groei van isolaten, die niet biotype afhankelijk zijn. Om de virulentie-expressie optimaal te stimuleren, zijn echter onafhankelijke biotype-specifieke cultiveringsmethoden vereist. 19 . Daarnaast worden voorbereidingen voor diverse genetische en biochemische analyses beschreven in dit manuscript.
Cholera toxine (CT) en de toxine co-reGeulate pilus (TCP) zijn twee belangrijkste virulentie factoren die worden geregeld door de master regulator ToxT in beide biotypen van de V. Cholerae O1 serogroep 20 . CT is een twee-deeltjes toxine samengesteld uit vijf CtxB Subeenheden die een enkele CtxA subeenheid omringen en verantwoordelijk zijn voor het snelle elektrolytverlies geassocieerd met cholera. TCP is een type IV pilus gecodeerd door de tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ), en is betrokken bij de bevestiging en kolonisatie van de distale dunne darm. TcpA is het eerste gen van de tcp operon die codeert voor de individuele pilin subunits die essentieel zijn voor de constructie van de pilus 8 . De gensequentie voor ctxA is volledig geconserveerd tussen klassieke en El Tor- biotypen , terwijl ctxB en tcpA verschillen over de twee biotypes, maar worden bewaard binnen elk biotype 8 . CtxB is volledig bewaard tussen biotypes, behalve bij twee basisposi(115 en 203). In het El Tor biotype woont thymine bij basisposities 115 en 203, terwijl het klassieke biotype cytosine bij deze basen bevat. TcpA is volledig bewaard binnen elk biotype, maar verschilt op meerdere bases tussen biotypes. Deze genetische onderscheidingen dienen als primaire biotype identificatiemarkers, en na sequencing van het polymerase kettingreactie (PCR) amplificatieproduct omvattende deze sites kunnen isolate sequenties worden vergeleken met wildtype (WT) klassieke O395 of WT El Tor N16961 om de biotype achtergrond te bepalen Van respectievelijk CT en TCP, in een gegeven V. cholerae isolaat.
Er zijn veel protocollen ontwikkeld om de fenotypische onderscheidingen te karakteriseren tussen de klassieke en El Tor biotypes 21 , 22 , 23 . Polymyxine B is een peptide antibioticum dat de integriteit van het buitenste celmembraan in Gram-negatieve bac compromiseertTeria en polymyxine B resistentie kunnen worden weergegeven door middel van de polymyxine B resistentie assay 21 . Citraat is een primaire substraat van de Kreb-cyclus, en het vermogen om citraat te metaboliseren als enige koolstofbron kan worden bepaald met behulp van de citraatmetabolisme-analyse 22 . HapR codeert voor een globale regulator en de master quorum sensing regulator in V. cholerae, HapR, die bindt aan verschillende promotor regio's en regelt gen- en operon expressie 24 . Sommige pathogene stammen van V. cholerae hebben een natuurlijk voorkomende frame-shift mutatie in het hapR gen dat heeft geleid tot deze dichtheidsafhankelijke regulering van de virulentie genuitdrukking 24 , 25 verloren gaan. Het meten van HapR-gereguleerde protease-activiteit met behulp van melkagaremedia laat de onderzoeker toe om te bepalen of een specifiek isolaat een functionele HapR 23 bevat . DeHemolyse assay tests voor het vermogen van een stam hemolytische enzymen af te scheiden die rode bloedcellen lichten; De mate van hemolyse kan worden weergegeven op bloed agarplaten 23 . Motiliteit wordt vaak geassocieerd met virulentie in V. cholerae en kan geanalyseerd worden met behulp van motiliteitsagarplaten 23 . De Voges-Proskauer test test voor het vermogen van glucose om glucose als een koolstofbron te fermenteren en de bijproduct acetoïne 21 te produceren. Met de opkomst van El Tor varianten is het moeilijk om de resultaten van een gegeven fenotypische test te voorspellen zonder uitgebreid genotype screening en voordat de biotype achtergrond van V wordt afgetrokken. Cholerae isolaten, wordt het aanbevolen dit samenstel van analyses 23 uit te voeren en de resultaten te vergelijken met referentiestammen zoals in Tabel 2 .
Hierin hebben we een reeks protocollen geavanceerd, die collectief gebruik maken van de aforemNtioned genotypische en fenotypische analyses voor een meer uitgebreide aanpak om V te karakteriseren. Cholerae biotypes. Verder hebben we de genotypische en fenotypische onderscheidingen van bekende V beschreven. Cholerae El Tor varianten (MQ1795 en BAA-2163), in vergelijking met veelgebruikte biotype referentiestammen (WT klassieke O395, WT El Tor C6706 en WT El Tor N16961; Tabel 1 ). De opkomst van El Tor varianten heeft uitdagingen voorgedragen aan de betrouwbaarheid van eerder gebruikte single-assay biotype karakterisering protocollen; Dit multiple assay identificatie systeem zal echter toelaten voor betrouwbare karakterisering van klinische en milieu V. Cholerae isolaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Van de meer dan 200 geïdentificeerde V. Cholerae serogroepen, alleen O1 en O139 hebben epidemische mogelijkheden. De O1 serogroep kan worden verdeeld in twee biotypes: klassiek en El Tor. Echter, hybride stammen, genaamd El Tor varianten 13 , 17 , zijn opgetreden die de El Tor biotype achtergrond bezitten en klassieke kenmerken 8 , 9 , 10 , <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek ondersteund door New Hampshire-INBRE via een Institutions Development Award (IDeA), P20GM103506, van het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Anhydrous K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Blood Agar Plates | Remel | R01200 | Store at 4 °C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromothymol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Cirtric acid ·H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
| HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Corrosive; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4·7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
| MR-VP Broth | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
| NaNH4HPO4·4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
| Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Petri Dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Petri Dishes (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Reaction Buffer | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Triphenyltetrazolium chloride | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Tris∙HCl | Calbiochem | 9310 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride—CAS-1185-53-1—Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP |
| Tryptone | Becto, Dickinson and Co. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Yeast Extract | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
References
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
- Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
- Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
- Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
- Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
- Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
- Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
- Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
- Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
- Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
- Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
- Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
- Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
- Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
- Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
- Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
- Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
- Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
- DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
- Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
- Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
- Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
- Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
- Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).
