A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas.
Las poblaciones de células heterogéneas, ya sea de tejidos sanos o malignos, pueden contener una población de células caracterizada por una capacidad diferencial para expulsar el colorante de enlace de ADN Hoechst 33342. Esta "población lateral" de células puede identificarse usando métodos de citometría de flujo después de Hoechst 33342 El colorante es excitado por un láser ultravioleta (UV). La población lateral de muchos tipos de células contiene células progenitoras o similares. Sin embargo, no todos los tipos de células tienen una población lateral identificable. Danio rerio , pez cebra, tienen un robusto modelo in vivo de células T de leucemia linfoblástica aguda (T-ALL), pero si estas T-ALL de pez cebra tienen una población lateral es desconocida. El método descrito aquí describe cómo aislar las células de la población lateral en el pez cebra T-ALL. Para empezar, el T-ALL en el pez cebra se genera a través de la microinyección de los plásmidos tol2 en embriones de una sola fase celular. Una vez que los tumores han crecido a una etapa en la que se expanden en más de la mitad de los aniEl cuerpo de mal, las células T-ALL se puede cosechar. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 y se examinaron por citometría de flujo para células de población lateral. Este método tiene amplias aplicaciones en el pez cebra T-ALL investigación. Si bien no se conocen marcadores de superficie celular en el pez cebra que confirman si estas células de población lateral son células madre de cáncer como, ensayos in vivo de trasplante funcionales son posibles. Además, transcriptómica sola célula podrían aplicarse para identificar las características genéticas de estas células de población lateral.
El ensayo población lado capitaliza en la capacidad mejorada de ciertas células dentro de un tejido a flujo de salida el colorante de unión a ADN Hoechst 33342 debido a los altos niveles de la casete de unión a ATP (ABC) transportador de proteínas en la membrana celular. Las células que eflujo el colorante Hoechst 33342 se pueden identificar utilizando análisis de citometría de flujo dual de longitud de onda después de que el colorante es excitado por un láser UV. Este ensayo se utilizó primero para identificar células murinas madre hematopoyéticas (HSCs) 1, pero desde entonces se ha usado para identificar poblaciones de células madre / progenitoras en muchos tejidos y tipos de cáncer (revisado en la referencia 2). Sin embargo, no todas las poblaciones de células tienen una población lado, y no todas las poblaciones laterales están enriquecidas en células madre / progenitoras.
El pez cebra es un poderoso sistema modelo para el estudio genético de los vertebrados cáncer humano 3, 4, con una serie de ventajas sobre mo tradicional murinadels de cáncer. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y son ópticamente transparentes, lo que facilita la transgénesis y la observación in vivo de procesos patológicos, incluyendo la iniciación y progresión del cáncer. Hasta la fecha, el ensayo población lado para detectar potenciales células madre o progenitoras sólo se ha aplicado a la médula renal en el pez cebra para identificar HSCs, y no a cualquier modelos de cáncer de pez cebra 5, 6.
El modelo de pez cebra de las células T de la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) es morfológica y genéticamente similares a humano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL es una neoplasia agresiva que, en los seres humanos, representa el 10-15% de los pediátricos y el 25% de los casos de LLA de adultos 9. Mientras que el tratamiento de la LLA-T ha mejorado, la recaída es todavía común y se asocia con un mal pronóstico. T-ALL tumores son hétérogèneY contienen muchas subpoblaciones de células tumorales diferentes, incluyendo células iniciadoras de leucemia (LICs). Los LIC se definen por su capacidad para regenerar el tumor entero a partir de una sola célula y la frecuencia de LIC dentro de una población de células tumorales se puede calcular trasplantando dosis de células variables en receptores a través de un ensayo de trasplante de dilución limitante (LDA). Mientras que los experimentos de LDA se han realizado en el pez cebra para calcular la frecuencia de los LIC 8 , 10 , 11 , esta determinación se hace en retrospectiva y no permite el aislamiento prospectivo de LICs. Por lo tanto, falta un método para aislar prospectivamente una población enriquecida para la actividad de células madre de cáncer. Identificar y aislar las células de la población lateral de pez cebra T-ALLs es el primer paso para abordar esta deficiencia.
El protocolo presentado aquí describe cómo generar eficientemente tumores T-ALL en zebrafish la utilización de transgénesis Tol2 mediada, cosechar las Todas Las células tumorales, y manchar con Hoechst 33342 para identificar la población lado de las células. Future en experimentos in vivo con el pez cebra T-ALL podría incluir si las células de población lateral están enriquecidos para los PRB o tienen otras propiedades stem- o progenitoras-similares.
El ensayo de población lateral es altamente sensible; Por lo tanto, pequeños cambios en el protocolo pueden resultar en una dificultad en la detección de células de población lateral. En primer lugar, la temperatura durante la etapa de tinción es específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, el ensayo de población lateral se realiza típicamente a 37ºC. Cuando las células T-ALL de pez cebra se incubaron a 37ºC, muchas de las células murieron, lo que hizo que esta temperatura …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Chicago Consejo de la Mujer, el Fondo caso será Wendy, y la Universidad de Chicago Comprehensive Cancer Center Proyectos financiados (P30 CA014599). Nos gustaría dar las gracias a la Citometría de Flujo Core de la Universidad de Chicago, por su ayuda en la creación de este experimento, y así como otros miembros del laboratorio de Jong, en especial Leslie Pedraza y Sean McConnell.
Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |