Aqui, descrevemos uma técnica para isolar as células de população lateral de um modelo zebrafish de leucemia linfoblástica aguda induzida por myc-T (T-ALL). Este ensaio de população lateral é altamente sensível e é descrito para T-ALL de peixe-zebra, mas pode ser aplicável a outros tipos de células zebrafish malignas e não malignas.
populações celulares heterogéneas, a partir de qualquer dos tecidos saudáveis ou malignas, podem conter uma população de células caracterizadas por uma capacidade diferencial para efluxo do corante de ligao a ADN Hoechst 33342. Este "população lado" de células podem ser identificados utilizando métodos de citometria de fluxo após a Hoechst 33342 corante é excitado por um (UV) do laser ultravioleta. A população lado de muitos tipos de células contem células progenitoras de haste ou semelhante. No entanto, nem todos os tipos de células têm uma população lado identificável. Danio rerio, peixe-zebra, tem um robusto em modelo vivo de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T), mas se estes T-alls peixe-zebra tem uma população lado é desconhecida. O método descrito aqui descreve como para isolar as células da população lado em peixes-zebra T-ALL. Para começar, a T-ALL no peixe-zebra é gerado através da microinjeção de plasmídeos tol2 em embriões em estágio de uma célula. Uma vez que os tumores cresceram a uma fase em que eles se expandir para mais de metade do aniO corpo de mal, as células T-ALL podem ser colhidas. As células são depois coradas com Hoechst 33342 e examinadas por citometria de fluxo para as células da população lado. Este método tem amplas aplicações em peixe-zebra T-ALL pesquisa. Embora não existam marcadores de superfície celular conhecidos no peixe-zebra que confirmam se estas células da população lado são células-tronco como cancro, in vivo, ensaios de transplante funcionais são possíveis. Além disso, transcriptómica de célula única poderiam ser aplicados para identificar as características genéticas destas células população lado.
O ensaio população lado capitaliza sobre a capacidade aumentada de determinadas células dentro de um tecido que efluxo o corante de ligao ao ADN Hoechst 33342, devido aos elevados níveis da cassete de ligao de ATP (ABC) proteínas transportadoras sobre a membrana celular. As células que efluxo o corante Hoechst 33342 pode ser identificado utilizando análise de citometria de fluxo duplo comprimento de onda após o corante é excitada por um laser de UV. Este ensaio foi utilizado pela primeira vez para identificar células estaminais hematopoiéticas murinas (HSCs) 1, mas foi uma vez utilizado para identificar populações de células estaminais / progenitoras em muitos tecidos e tipos de cancro (revisto em referência 2). No entanto, nem todas as populações de células têm uma população lado, e nem todas as populações laterais são enriquecidas para as células estaminais / progenitoras.
O peixe-zebra é um poderoso vertebrado sistema modelo genético para o estudo do cancro humano 3, 4, com um número de vantagens em relação mo murino tradicionaldels de cancro. Embriões de peixe-zebra são externamente fertilizado e são opticamente transparentes, facilitando transgénese e a observação in vivo de processos patológicos, incluindo a iniciação e progressão do cancro. Até à data, o ensaio população lado para detectar potenciais de células estaminais ou progenitoras só foi aplicada para a medula do rim em peixes-zebra para identificar HSCs, e não a quaisquer modelos de cancro de peixe-zebra 5, 6.
O modelo de peixe-zebra de células T de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) é morfologicamente e geneticamente semelhante ao humano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL é uma neoplasia agressiva que, em humanos, é responsável por 10-15% dos pediátrica e 25% dos adultos TODOS os casos 9. Embora o tratamento de LLA-T tem melhorado, recaída ainda é comum e está associado a um prognóstico pobre. T-ALL tumores são hétérogèneous e conter muitas subpopulações de células de tumor diferentes, incluindo leucemia iniciar células (PBR). PBR são definidas pela sua capacidade de voltar a crescer todo o tumor a partir de uma única célula, e a frequência de PBR dentro de uma população de células de tumor pode ser calculado através do transplante de células doses variadas para receptores por meio de um ensaio de transplante de diluição limitante (LDA). Embora as experiências foram efectuadas de LDA em peixes-zebra para calcular a frequência de PBR 8, 10, 11, esta determinação é feita em retrospectiva e não permite o isolamento potencial do PBR. Por conseguinte, um método para isolar prospectivamente uma população enriquecida em actividade de células estaminais do cancro é inexistente. A identificação e isolamento de células da população lado de peixe-zebra t-alls é o primeiro passo no sentido de resolver esta deficiência.
O protocolo aqui apresentado descreve como gerar de forma eficiente T-ALL tumores em ZEBRafish utilizando transgénese mediada por tol2, a colheita das células T-ALL tumores, e mancham-los com Hoechst 33342 para identificar a população de células lado. Futuro em experiências in vivo com peixe-zebra LLA-T poderia incluir se as células da população lateral são enriquecidos para os PBR ou têm outras propriedades de haste ou progenitoras semelhantes.
O ensaio de população lateral é altamente sensível; Portanto, pequenas alterações no protocolo podem resultar em uma dificuldade na detecção de células populacionais laterais. Em primeiro lugar, a temperatura durante o passo de coloração é específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, o ensaio de população lateral é tipicamente realizado a 37 ° C 2 . Quando as células T-ALL de zebrafish foram incubadas a 37 ° C, muitas das células morreram, o q…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela University of Chicago Women's Board, o Wendy Will Case Fund, e da Universidade de Chicago Comprehensive Cancer Center Grant Grant (P30 CA014599). Gostaríamos de agradecer ao Flow Cytometry Core da Universidade de Chicago por sua ajuda na criação deste experimento, bem como outros membros do laboratório de de Jong, particularmente Leslie Pedraza e Sean McConnell.
Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |