ここで、我々は、MYC誘導性のT細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)のゼブラフィッシュモデルからサイドポピュレーション細胞を単離する技術が記載されています。このサイドポピュレーションアッセイは、高感度であり、ゼブラフィッシュT-ALLのために記載されているが、他の悪性および非悪性のゼブラフィッシュの細胞型にも適用可能です。
異種細胞集団は、健常又は悪性のいずれかの組織から、DNA結合色素を流出する差動能力によって特徴づけられる細胞の集団を含んでいてもよいヘキスト33342細胞のこの「サイドポピュレーション」は、ヘキスト33342の後にフローサイトメトリー法を用いて同定することができます染料は、紫外線(UV)レーザによって励起されます。多くの細胞型のサイドポピュレーションは、ステムまたは前駆細胞様細胞が含まれています。しかし、全ての細胞型は、識別可能なサイドの人口を持っていません。 ゼブラフィッシュ 、ゼブラフィッシュは、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL) のin vivoモデルで堅牢なを持っているが、これらのゼブラフィッシュT-オールズは、サイドポピュレーションを持っているかどうかは不明です。ここで説明する方法は、ゼブラフィッシュのT-ALLにおけるサイドポピュレーション細胞を単離する方法について説明します。開始するには、ゼブラフィッシュにおけるT-ALLは1細胞期胚にTOL2プラスミドのマイクロインジェクションを介して生成されます。腫瘍は、彼らがより多くのANIの半分以上に拡大した段階まで成長したらT-ALL細胞を回収することができる。次いで、細胞をHoechst 33342で染色し、側面集団細胞についてフローサイトメトリーにより検査する。この方法は、ゼブラフィッシュのT-ALL研究において幅広い用途を有する。ゼブラフィッシュには、これらの側方集団細胞が癌幹細胞様であるかどうかを確認する既知の細胞表面マーカーは存在しないが、 in vivo機能性移植アッセイが可能である。さらに、これらの側方集団細胞の遺伝的特徴を同定するために、単一細胞トランスクリプトミクスを適用することができる。
側方集団アッセイは、細胞膜上の高レベルのATP結合カセット(ABC)トランスポータータンパク質のために、DNA結合色素Hoechst 33342を流出させる組織内の特定の細胞の増強された能力を利用する。 Hoechst 33342色素を流出する細胞は、色素がUVレーザーによって励起された後、二波長フローサイトメトリー分析を用いて同定することができる。このアッセイは、マウス造血幹細胞(HSC) 1を同定するために最初に用いられたが、その後、多くの組織および癌において幹/前駆細胞集団を同定するために使用されている(参考文献2で検討されている)。しかし、細胞の集団のすべてに側面集団があるわけではなく、すべての側面集団が幹/前駆細胞に対して富化されているわけではありません。
ゼブラフィッシュは、ヒトの癌を研究するための強力な脊椎動物遺伝モデルシステムです3,4、伝統的なマウスよりも多くの利点がありますがんのうずき。ゼブラフィッシュの胚は外部から受精され、光学的に透明であり、遺伝子導入および癌開始および進行を含む病理学的プロセスのインビボでの観察を促進する。今日まで、可能性のある幹細胞または前駆細胞を検出するための側方集団検定は、ゼブラフィッシュの腎臓骨髄にのみ適用され、HSCを同定したが、ゼブラフィッシュ癌モデルではなかった 5,6 。
T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)のゼブラフィッシュモデルは、形態学的および遺伝的にヒトT-ALL 7,8,11に類似している。 T-ALLは、ヒトでは小児の10-15%、成人ALLの25%を占める攻撃的悪性腫瘍である9 。 T-ALLの治療が改善されたが、再発は依然として一般的であり、予後不良と関連している。 T-ALL腫瘍は異種遺伝子であるOUとは、白血病開始細胞(低所得国)を含む多くの異なる腫瘍細胞の亜集団を含みます。低所得国は、単一細胞から腫瘍全体を再成長する能力によって定義され、腫瘍細胞集団内で低所得国の周波数は、限界希釈移植アッセイ(LDA)を介して、レシピエントに変化する細胞用量を移植することにより算出することができます。 LDAの実験は低所得国8、10、11の周波数を計算するためにゼブラフィッシュで行われているが、この決意は、後知恵で作られており、低所得国の将来の分離を可能にしません。そのため、プロスペクティブにがん幹細胞活性のために濃縮された集団を分離する方法が欠けています。ゼブラフィッシュT-オールズからサイドポピュレーション細胞を同定および単離することは、この欠点に対処する第一歩です。
ここで紹介するプロトコルは、効率的にzebrでT-ALL腫瘍を生成する方法について説明しますT-ALL腫瘍細胞を採取し、Hoechst 33342でそれらを染色して、細胞の側面集団を同定する。ゼブラフィッシュT-ALLを用いた将来のin vivo実験には、側方集団細胞がLICに対して富化されているか、または他の幹または前駆体様の特性を有するかどうかが含まれ得る。
側方集団検定は非常に感度が高い。したがって、プロトコールのわずかな変更は、側方集団細胞を検出することを困難にする可能性がある。第1に、染色工程中の温度は、各動物/細胞系に特異的である。哺乳動物系では、側方集団検定は典型的には37℃で実施される 。ゼブラフィッシュT-ALL細胞を37℃でインキュベートすると、多くの細胞が死んだため、このインキュベーシ?…
The authors have nothing to disclose.
この研究はシカゴ大学女性委員会、ウェンディウィル症例基金、シカゴ大学総合がんセンター支援グラント(P30 CA014599)の支援を受けました。シカゴ大学のフローサイトメトリーコア(Flow Cytometry Core)に感謝したいと思います。この実験の設立には、ドゥ・ジョン研究所の他のメンバー、特にレスリー・ペドラザとショーン・マッコネルもお手伝いします。
Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific – AM1340 | 25 reactions |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific – NC0342409 | 100 g |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific – SH3007103 | 500 mL |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) – 500 mL |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 – 300 unit vials |
40 um mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL – Solution (0.4%) |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |