Análisis fenotípico de las etapas de la sangre asexual y sexual del parásito de la malaria de los roedores y las etapas de los mosquitos

Summary

Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos del paludismo de roedores con los parásitos del paludismo humano, los modelos de malaria de roedores se han vuelto indispensables para la investigación del paludismo. En este documento, estandarizamos algunas de las técnicas más importantes utilizadas en el análisis fenotípico de especies de malaria de roedores de tipo salvaje y transgénico.

Abstract

Los recientes avances en las tecnologías de la genética y la biología de los sistemas han promovido nuestra comprensión de la biología de los parásitos de la malaria a nivel molecular. Sin embargo, las metas eficaces de los parásitos del paludismo para el desarrollo de vacunas y quimioterapia siguen siendo limitadas. Esto se debe en gran medida a la indisponibilidad de modelos de infección in vivo relevantes y prácticos para las especies humanas de Plasmodium, sobre todo para P. falciparum y P. vivax. Por lo tanto, las especies de malaria de roedores se han utilizado ampliamente como modelos prácticos alternativos in vivo para la vacuna contra el paludismo, la segmentación de fármacos, la respuesta inmunitaria y los estudios de caracterización funcional de los genes Plasmodiumspp conservados. De hecho, los modelos de malaria de roedores han demostrado ser invaluables, especialmente para explorar la transmisión de mosquitos y la biología de la etapa hepática, y eran indispensables para los estudios inmunológicos. Sin embargo, existen discrepancias en los métodos utilizados para evaluar los fenotipos de los parásitos transgénicos y de tipo salvaje asexual y sexual en estadio sanguíneo. Ejemplos de estas discrepancias son la elección de una infección intravenosa frente a la infección intraperitoneal de roedores con parásitos en estadio sanguíneo y la evaluación de la exflagelación de gametos masculinos. En este documento, detallamos métodos experimentales estandarizados para evaluar los fenotipos de las etapas de la sangre asexual y sexual en parásitos transgénicos que expresan especies de parásitos de la malaria de roedores de tipo reportero o salvaje. También detallamos los métodos para evaluar los fenotipos de las etapas de los mosquitos parásitos de la malaria (gametos, ookinetes, ovocitos y esporozoitas) dentro de los vectores de mosquitos Anopheles. Estos métodos se detallan y simplifican aquí para las cepas letales y no letales de P. berghei y P. yoelii, pero también se pueden aplicar con algunos ajustes a las especies de malaria de roedores P. chabaudi y P. vinckei.

Introduction

Los parásitos de la malaria causan cientos de millones de infecciones por paludismo en humanos en todo el mundo, con más de 600.000 muertes cada año¹. Las infecciones humanas son causadas por cinco especies de parásitos de la malaria, a saber, P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaey P. knowlesi. La mayoría de las muertes clínicas por paludismo son causadas por P. falciparum en el Africa subsahariana¹. Otra especie de parásito de la malaria humana que causa grandes morbilidades en todo el mundo fuera del Africa subsahariana es P. vivax². Las otras tres especies están más restringidas geográficamente y causan infecciones benignas de malaria, excepto la letal P. knowlesi3. La indisponibilidad de modelos pertinentes y prácticos de infecciones no humanas in vivo siempre ha sido y sigue siendo un obstáculo para la vacuna contra el paludismo y el desarrollo de medicamentos. Los estudios metabólicos y de la focalización de los medicamentos para el paludismo anteriores han dependido ampliamentede modelos de malaria aviar como P. gallinaceum y P. lophurae,infectando pollos y patos, respectivamente 4. A partir de entonces, las especies de malaria de roedores se introdujeron gradualmente en varias vacunas y estudios de segmentación de fármacos como modelos in vivo. A lo largo de los años, se han acumulado evidencias de similitudes de la biología y las interacciones huésped-parásito de las etapas del ciclo de vida de los modelos de malaria de roedores con las especies de malaria humana.

En particular, los modelos de malaria de roedores fueron extremadamente importantes paraexplorar y caracterizar la biología de las etapas 5 de mosquitos y preeritróticos. Sin embargo, hay cuatro especies de malaria de roedores (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi,y P. vinckei) que tienen diferentes características biológicas, las más notables de las cuales se encuentran en las etapas de la sangre⁶. Las especies de malaria de roedores difieren en la sincronicidad de las etapas de la sangre, donde las etapas de la sangre de las cepas de P. chabaudi y P. vinckei son en su mayoría sincrónicas, mientras que las etapas de sangre de P. berghei y P. yoelii no son^{6 , 7}. Otra diferencia notable es el autoaclaramiento delas etapas de la sangre que se produce en algunas cepas (por ejemplo, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, y P. vinckei lentum), mientras que la infección sanguínea de otras cepas de la misma especie podrían ser letales si no se tratan (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, y P. chabaudi AS). Además, la cepa P. yoelii 17X-NL y la cepa P. berghei ANKA invaden preferentemente reticulocitos^8,9,10,11, aunque estas características de P. Las cepas yoelii y P. berghei no son un estricto requisito de crecimiento^12,13,14. Por lo tanto, los ratones son tratados con fenilhidrazina antes de una infección con las etapas de la sangre de esos parásitos para aumentar la parasitamia y la gamecitomia necesarias para una infección por mosquitos para la cepa P. berghei ANKA y para P. yoelii 17X-NL^{15,16,17,18,19}.

También existen diferencias en el desarrollo de las etapas de los mosquitos entre las diferentes especies depaludismo de roedores, siendo la más notable la temperatura y el tiempo necesarios para el desarrollo óptimo de las etapas de los mosquitos y la longitud 5,^{6, 20}. En las etapas preeritroccíticas de las especies de paludismo de roedores, las diferencias incluyen las especies de roedores y la cepa que son más susceptibles a la inoculación infecciosa de esporozoita, el número de esporozoitos necesarios para la inoculación en una cepa de roedores susceptible, el tipos de células de mamíferos necesarias para los ensayos de desarrollo de la etapa hepática in vitro, y el tiempo para completar el desarrollo de la etapa hepática^{5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30}.

A pesar de estas variabilidades, los parásitos del paludismo de los roedores fueron los modelos favorables desde el principio para la aplicación de enfoques genéticos inversos, porque conllevarban menos tiempo y recursos con una alta probabilidad de éxito³¹. De hecho, los modelos de malaria de roedores fueron los mejores modelos, y en muchos casos los únicos modelos, disponibles durante muchos años para caracterizar funcionalmente los genes expresados en las etapas de mosquitos y hígado.

A la luz de la popularidad y amenabilidad de los enfoques genéticos inversos en los modelos de malaria de roedores, se han utilizado una serie de metodologías diferentes para analizar los fenotipos de las etapas del ciclo de vida del parásito transgénico, especialmente las etapas de la sangre. Sin embargo, algunas de estas metodologías son inconsistentes; por ejemplo, comparando las infecciones de parásitos en estadio sanguíneo después de una inyección de IP (que posiblemente se drenan a los ganglios linfáticos peritoneales y, a partir de ahí, pueden entrar en el torrente sanguíneo; por lo tanto, los parásitos inyectados no terminan por igual en el torrente sanguíneo) , comparando la transmisión de mosquitos de clones con un número diferente de transferencias en estadio sanguíneo serie o número G (que podrían afectar a la gametocitogénesis^32,33), o comparar parásitos transgénicos directamente con el tipo salvaje ingenuo (WT) parásitos que nunca fueron sometidos a electroporación y selección positiva de fármacos y a las diversas evaluaciones no estandarizadas de la exflagelación de gametomasculino masculino. Por lo tanto, es crucial estandarizar los protocolos que son fáciles de seguir para el análisis fenotípico de cualquier tipo de parásitos transgénicos o WT de malaria de roedores en la sangre y en el mosquito para adaptarse a las variabilidades biológicas del paludismo de roedores especies de parásitos.

Aquí, informamos sobre un protocolo experimental estandarizado y detallado para el análisis fenotípico de las etapas del ciclo de vida de la sangre y mosquitos de los parásitos transgénicos o salvajes P. yoelii y P. berghei. Estos protocolos también son aplicables a los parásitos P. chabaudi y P. vinckei.

Protocol

Todos los experimentos con animales descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tulane y el comité de ética de animales de la Universidad Bezmialem Vakif. Todos los demás protocolos experimentales y el uso de ADN recombinante se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad de Tulane. 1. Infección de rat…

Representative Results

El éxito de la aplicación de herramientas y técnicas genéticas inversas a los parásitos del paludismo ha revolucionado el campo de la investigación del paludismo, con la capacidad de añadir, eliminar o modificar segmentos genómicos específicos de varias especies de Plasmodium 39. Es importante destacar que los loci genómicos prescindibles se han identificado y utilizado con éxito para introducir marcadores de proteínade fluorescencia en parási…

Discussion

A pesar de la similitud en la biología general de sus ciclos de vida con la de los parásitos de la malaria humana, los modelos de malaria de ratón también tienen muchas diferencias con las especies humanas de Plasmodium que limitarían su uso como modelos in vivo fiables. Por ejemplo, con la excepción de los parásitos vivos atenuados como vacunas, todos los estudios de vacunas con subunidad es y el ADN y otras vacunas dieron excelentes resultados en el modelo de ratón, pero en los seres humanos q…

Materials

Heparin	Sigma	375095-100KU
Xanthurenic acid	Sigma	D120804-5G
Hypoxanthine	Sigma	H9377-25G
Alsever's solution	Sigma	A3551-500ML
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Phenylhydrazine	Sigma	P26252-5G
Glycerol	Sigma	G5516-500ML
Giemsa	Sigma	GS1L-1L
26G x 3/8 Precision Glide Needle,	Becton Dickinson	305110
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8	Becton Dickinson	309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G	Becton Dickinson	329412
Isoflurane, USB	Piramal	2667- 46- 7
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
RPMI	Gibco	22400105
DMEM	Gibco	11995065
Pencillin/ Streptomycin	Gibco	10378016
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147
Fiber Glass Wool	Corning	3950