Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.
Jüngste Fortschritte in der Genetik und Systembiologie haben unser Verständnis der Biologie von Malariaparasiten auf molekularer Ebene gefördert. Die effektiven Malariaparasitenziele für die Entwicklung von Impfstoffen und Chemotherapien sind jedoch nach wie vor begrenzt. Dies ist weitgehend auf die Nichtverfügbarkeit relevanter und praktischer In-vivo-Infektionsmodelle für humane Plasmodium-Arten zurückzuführen, insbesondere für P. falciparum und P. vivax. Daher wurden Nagetier-Malaria-Arten ausgiebig als praktische Alternative für Malaria-Impfstoffe, Wirkstoff-Targeting, Immunantwort und funktionelle Charakterisierungsstudien konservierter Plasmodiumspp-Gene eingesetzt. Tatsächlich haben sich Nagetier-Malariamodelle als von unschätzbarem Wert erwiesen, insbesondere für die Erforschung der Mückenübertragung und der Biologie im Leberstadium, und waren für immunologische Studien unverzichtbar. Es gibt jedoch Unterschiede in den Methoden zur Bewertung der Phänotypen von transgenen und wildtypen asexuellen und sexuellen Blutstadiumparasiten. Beispiele für diese Diskrepanzen sind die Wahl einer intravenösen vs. intraperitonealen Infektion von Nagetieren mit blutenden Parasiten und die Bewertung der männlichen Gamete-Exflagellation. Hierin beschreiben wir standardisierte experimentelle Methoden zur Bewertung der Phänotypen von asexuellen und sexuellen Blutstadien bei transgenen Parasiten, die Reporter-Gen oder wilde Nagetier-Malariaparasitenarten exemittieren. Wir beschreiben auch die Methoden zur Bewertung der Phänotypen von Malariaparasitenmückenstadien (Gameten, Ookinete, Oozysten und Sporozoiten) in Anopheles-Mückenvektoren. Diese Methoden sind hier detailliert und vereinfacht für die tödlichen und nicht-tödlichen Stämme von P. berghei und P. yoelii, können aber auch mit einigen Anpassungen an P. chabaudi und P. vinckei Nagetier Malariaarten angewendet werden.
Malariaparasiten verursachen weltweit Hunderte Millionen von Malariainfektionen beim Menschen, mehr als 600.000 Todesfälle pro Jahr1. Menschliche Infektionen werden durch fünf Malariaparasitenarten verursacht, nämlich P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaeund P. knowlesi. Die meisten klinischen Malaria-Sterblichkeiten werden durch P. falciparum in Afrika südlich der Saharaverursacht 1. Eine weitere menschliche Malariaparasitenart, die außerhalb Afrikas südlich der Sahara umfangreiche weltweite Morbiditäten verursacht, ist P. vivax2. Die anderen drei Arten sind alle geografisch stärker eingeschränkt und verursachen gutartige Malariainfektionen, mit Ausnahme der tödlichen P. knowlesi3. Die Nichtverfügbarkeit relevanter und praktischer nichtmenschlicher In-vivo-Modelle von Infektionen war und ist immer noch ein Hindernis für Malaria-Impfstoffe und die Entwicklung von Medikamenten. Frühere Malaria-Medikamente Targeting und Metabolische Studien haben sich weitgehend auf Aviäre Malaria-Modelle wie P. gallinaceum und P. lophuraeverlassen, hühner und enten zu infizieren, bzw.4. Danach wurden Nagetier-Malaria-Arten nach und nach in verschiedenen Impfstoffen und Medikamenten-Targeting-Studien als In-vivo-Modelle eingeführt. Im Laufe der Jahre haben sich Hinweise auf Ähnlichkeiten der Biologie und der Wirtsparasiten-Wechselwirkungen von Lebenszyklusstadien von Nagetier-Malariamodellen mit menschlichen Malariaarten angesammelt.
Insbesondere Nagetier-Malaria-Modelle waren extrem wichtig, um die Biologie von Mücken und präerythrozytischen Stadien zu erforschen und zu charakterisieren5. Es gibt jedoch vier Nagetier-Malaria-Arten (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudiund P. vinckei), die unterschiedliche biologische Merkmale aufweisen, von denen die bemerkenswertesten in den Blutstadien6sind. Nagetier-Malaria-Arten unterscheiden sich in der Synchronität der Blutstadien, wo blutbildende Stadien von P. chabaudi und P. vinckei Stämmen meist synchron sind, während die Blutstadien von P. berghei und P. yoelii nicht6 sind. , 7. Ein weiterer bemerkenswerter Unterschied ist die Selbstclearance von Blutstadien, die in einigen Stämmen auftritt(z.B. , P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, und P. vinckei lentum), während die Blutinfektion anderer Stämme der gleichen Art könnten tödlich sein, wenn sie unbehandelt bleiben (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA und P. chabaudi AS). Darüber hinaus p. yoelii 17X-NL Stamm und P. berghei ANKA Stamm bevorzugt eindringen retikulozyten8,9,10,11, obwohl diese Merkmale von P. yoelii und P. berghei Stämme sind keine strenge Wachstumsanforderung12,13,14. Daher werden Mäuse mit Phenylhydrazin vor einer Infektion mit den Blutstadien dieser Parasiten behandelt, um die Parasiten- und Gametozytämie zu erhöhen, die für eine Mückeninfektion für den P. berghei ANKA-Stamm und für P. yoelii erforderlich sind. 17X-NL15,16,17,18,19.
Unterschiede in der Entwicklung der Mückenstadien gibt es auch zwischen verschiedenen Nagetier-Malaria-Arten, die bemerkenswertesten sind die Temperatur und Zeit für die optimale Entwicklung der Mückenstadien und die Sporozoit-Länge5,6, 20. In den präerythrozytischen Stadien von Nagetier-Malaria-Arten, Unterschiede umfassen die Nagetierarten und Stamm, die am anfälligsten für infektiöse Sporozoit-Inokulation sind, die Anzahl der Sporozoiten für die Impfung in einem anfälligen Nagetierstamm benötigt, Säugetierzelltypen für In-vitro-Leberstadium-Entwicklungstests benötigt, und die Zeit, um Leberstadium Entwicklungabzuschließen 5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Trotz dieser Variabilitäten waren Nagetier-Malariaparasiten schon früh die günstigen Modelle für die Anwendung von umgekehrten genetischen Ansätzen, da sie mit einer hohen Erfolgswahrscheinlichkeit weniger zeit- und ressourcenschonend waren31. Tatsächlich waren Nagetier-Malaria-Modelle die besten Modelle und in vielen Fällen die einzigen Modelle, die seit vielen Jahren zur funktionellen Charakterisierung von Genen in Mücken- und Leberstadien zur Verfügung stehen.
Angesichts der Popularität und Amenability von umgekehrten genetischen Ansätzen in Nagetier-Malaria-Modellen wurden eine Reihe verschiedener Methoden verwendet, um die Phänotypen der transgenen Parasiten-Lebenszyklusstadien, insbesondere der Blutstadien, zu analysieren. Einige dieser Methoden sind jedoch inkonsistent; zum Beispiel, Vergleich von Infektionen von Blut-Stadium Parasiten nach einer IP-Injektion (die möglicherweise auf die peritonealen Lymphknoten abgelassen werden und von dort aus in den Blutkreislauf gelangen können; daher landen die injizierten Parasiten nicht gleichmäßig im Blutkreislauf) , Vergleich der Mückenübertragung von Klonen mit einer unterschiedlichen Anzahl von seriellen Blutstufenübertragungen oder G-Nummern (die die Gametozytogenese32,33beeinflussen könnten), oder vergleicht transgene Parasiten direkt mit naivem Wildtyp (WT) Parasiten, die nie einer Elektroporation und positiven Medikamentenauswahl und den verschiedenen nicht standardisierten Bewertungen der männlichen Gamete-Exflagellation unterzogen wurden. Daher ist es wichtig, Protokolle zu standardisieren, die für die phänotypische Analyse jeder Art von transgenen oder WT Nagetier-Malariaparasiten im Blut und in der Mücke einfach zu befolgen sind, um die biologischen Variabilitäten der Nagetier-Malaria zu berücksichtigen. Parasitenarten.
Hierin berichten wir über ein standardisiertes, detailliertes Versuchsprotokoll zur phänotypischen Analyse der Blut- und Mückenlebenszyklusstadien von transgenen oder wilden P. yoelii- und P. berghei Parasiten. Diese Protokolle gelten auch für Parasiten von P. chabaudi und P. vinckei.
Trotz der Ähnlichkeit in der allgemeinen Biologie ihrer Lebenszyklen mit denen menschlicher Malariaparasiten haben Maus-Malaria-Modelle auch viele Unterschiede zu menschlichen Plasmodium-Arten, die ihre Verwendung als zuverlässige In-vivo-Modelle einschränken würden. Mit Ausnahme von lebend abgeschwächten Parasiten als Impfstoffe lieferten beispielsweise alle Impfstoffstudien mit Untereinheit und DNA und anderen Impfstoffen hervorragende Ergebnisse im Mausmodell, aber bei Menschen, die in endemisch…
The authors have nothing to disclose.
Ahmed Aly wird durch Fördermittel der Bezmialem Vakif Universität aus dem Stipendium des türkischen Entwicklungsministeriums 2015BSV036, durch Fördermittel der Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine und durch Fördermittel von NIH-NIAID für R21Grant unterstützt. 1R21AI111058-01A1.
Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
26G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G | Becton Dickinson | 329412 | |
Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
RPMI | Gibco | 22400105 | |
DMEM | Gibco | 11995065 | |
Pencillin/ Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |