Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Summary

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Abstract

Recente ontwikkelingen in de genetica en systemen biologie technologieën hebben ons begrip van de biologie van malariaparasieten op moleculair niveau bevorderd. Effectieve malariaparasiet doelen voor de ontwikkeling van vaccins en chemotherapie zijn echter nog steeds beperkt. Dit is grotendeels te wijten aan de onbeschikbaarheid van relevante en praktische in vivo infectie modellen voor menselijke Plasmodium soorten, met name voor p. falciparum en p. vivax. Daarom zijn knaagdier malaria soorten uitgebreid gebruikt als praktisch alternatief in vivo modellen voor malaria vaccin, drug targeting, immuunrespons, en functionele karakterisering studies van gecondengeerde Plasmodiumspp. genen. Inderdaad, knaagdier malaria modellen zijn van onschatbare waarde gebleken, vooral voor het verkennen van mug transmissie en lever stage biologie, en waren onmisbaar voor immunologische studies. Echter, er zijn verschillen in de methoden die worden gebruikt voor het evalueren van de fenotypes van transgene en wild-type ongeslachtelijke en seksuele bloed-fase parasieten. Voorbeelden van deze verschillen zijn de keuze van een intraveneuze versus intraperitoneale infectie van knaagdieren met bloed-fase parasieten en de evaluatie van mannelijke gameten exflagellatie. Hierin worden gestandaardiseerde experimentele methoden beschreven voor het evalueren van de fenotypes van ongeslachtelijke en seksuele bloed stadia in transgene parasieten die verslag doen van Reporter-gen of wild type knaagdier malariaparasieten. We ook detail de methoden voor het evalueren van de fenotypes van malariaparasiet muggen stadia (gameten, ookinetes, oöcysten, en sporozoites) in Anopheles muggen vectoren. Deze methoden zijn gedetailleerd en vereenvoudigd hier voor de dodelijke en niet-dodelijke stammen van p. berghei en p. yoelii maar kan ook worden toegepast met enkele aanpassingen aan p. chabaudi en p. vinckei knaagdier malaria soorten.

Introduction

Malariaparasieten veroorzaken honderden miljoenen malaria-infecties bij mensenwereld wijd, met meer dan 600.000 sterfgevallen per jaar¹. Menselijke infecties worden veroorzaakt door vijf malaria parasitaire soorten, namelijk p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, en p.kennis. De meeste klinische malaria sterfte wordt veroorzaakt door P. falciparum in Afrika ten zuiden van de Sahara¹. Een andere menselijke malariaparasiet soorten die grote wereldwijde Morbiditeiten buiten het Afrika bezuiden de Sahara veroorzaakt is P. vivax². De andere drie soorten zijn allemaal meer geografisch beperkt en veroorzaken goedaardige malaria-infecties, behalve de dodelijke P. Prosi³. De onbeschikbaarheid van relevante en praktische niet-humane in vivo-modellen van infecties is altijd geweest en is nog steeds een belemmering voor malaria vaccin en Geneesmiddelenontwikkeling. Eerdere malaria drugs targeting en metabole studies hebben uitgebreid vertrouwd op aviaire malaria modellen zoals p. gallinaceum en p. lophurae, het infecteren van kippen en eenden, respectievelijk⁴. Daarna werden knaagdier malaria soorten geleidelijk geïntroduceerd in verschillende vaccins en drugs targeting studies als in vivo modellen. In de loop der jaren, het bewijs van gelijkenissen van de biologie en gastheer-parasiet interacties van de levenscyclus stadia van knaagdieren malaria modellen aan menselijke malaria soorten hebben opgebouwd.

In het bijzonder waren Knaagdieren malaria modellen uiterst belangrijk om de biologie van muggen en pre-erytrocytische stadia⁵te verkennen en karakteriseren. Er zijn echter vier Knaagdieren malaria soorten (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, en p. vinckei) die verschillende biologische kenmerken hebben, waarvan de meest opvallende in de bloed stadia⁶. Knaagdier malaria soorten verschillen in de synchroniciteit van bloed stadia, waarbij bloed stadia van p. chabaudi en p. vinckei stammen zijn meestal synchroon, terwijl het bloed stadia van p. berghei en p. yoelii zijn niet^{6 , 7}. een ander opmerkelijk verschil is de zelf klaring van bloed stadia die voorkomt in sommige stammen (bijv. p. yoelii 17x-nl, p. berghei NK65 en P. vinckei lentum), terwijl de bloedinfectie van andere stammen van dezelfde soort kunnen dodelijk zijn indien onbehandeld (P. yoelii 17x-L, p. berghei ANKA, en P. chabaudi as). Bovendien, p. yoelii 17x-nl stam en p. berghei ANKA stam bij voorkeur de reticulocyten^8,9,10,11, hoewel deze kenmerken van p. yoelii en P. berghei stammen zijn niet een strikte groei eis^12,13,14. Daarom worden muizen behandeld met fenylhydrazine voorafgaand aan een infectie met de bloed stadia van die parasieten om de parasitemie en gametocytemia te verhogen die nodig zijn voor een mug-infectie voor de p. berghei ANKA-stam en voor p. yoelii 17x-nl^{15,16,17,18,19}.

Verschillen in muggen stadia ontwikkeling bestaan ook tussen verschillende Knaagdieren malaria soorten, de meest opvallende is de temperatuur en de tijd die nodig zijn voor optimale muggen stadia ontwikkeling en de sporozoite lengte^{5,6, 20}. In pre-erytrocytische stadia van knaagdier malaria soorten, verschillen omvatten de knaagdieren soorten en stam die het meest vatbaar zijn voor infectieuze sporozoïet inoculatie, het aantal sporozoieten nodig voor de inoculatie in een gevoelige knaagdier stam, de zoogdier celtypen nodig voor in vitro lever fase ontwikkeling testen, en de tijd om te voltooien van de ontwikkeling van de lever fase^{5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30}.

Ondanks deze variabele waren knaagdieren malariaparasieten eerder de gunstige modellen voor de toepassing van omgekeerde genetische benaderingen, omdat ze minder tijd en middelen verbruiken met een grote kans op succes³¹. In feite, knaagdieren malaria modellen waren de beste modellen, en in veel gevallen de enige modellen, beschikbaar voor vele jaren om functioneel te karakteriseren genen uitgedrukt in muggen en lever stadia.

In het licht van de populariteit en de mogelijkheden van omgekeerde genetische benaderingen in knaagdieren malaria modellen, een aantal verschillende methodologieën zijn gebruikt voor het analyseren van de fenotypes van transgene parasiet levenscyclus stadia, met name bloed stadia. Sommige van deze methoden zijn echter inconsistent; bijvoorbeeld, het vergelijken van infecties van bloed-fase parasieten na een IP-injectie (die mogelijk worden afgevoerd naar de peritoneale lymfeklieren en, vanaf daar, kan de bloedbaan in te voeren; daarom, de geïnjecteerde parasieten eindigen niet in de bloedbaan gelijk) , het vergelijken van de Mosquito transmissie van klonen met een verschillend aantal seriële bloed-fase overdrachten of G-nummer (die invloed kunnen hebben op gametocytogenesis^32,33), of het vergelijken van transgene parasieten rechtstreeks naar naïef wild-type (WT) parasieten die nooit werden onderworpen aan elektroporation en positieve drug selectie en de verschillende niet-gestandaardiseerde evaluaties van mannelijke gameten exflagellatie. Daarom is het cruciaal om protocollen te standaardiseren die eenvoudig te volgen zijn voor de fenotypische analyse van elk type transgene of WT knaagdier malariaparasieten in het bloed en in de mug om tegemoet te komen aan de biologische variabele van knaagdieren malaria parasietsoorten.

Hierin rapporteren we over een gestandaardiseerd, gedetailleerd experimenteel protocol voor de fenotypische analyse van het bloed en de levenscyclus van muggen van transgene of wild-type p. yoelii en p. berghei parasieten. Deze protocollen zijn ook van toepassing op p. chabaudi en p. vinckei parasieten.

Protocol

Alle dierproeven die hier beschreven werden, werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Tulane University en de dierenethiek Commissie van de Bezmialem Vakif Universiteit. Alle andere experimentele protocollen en het gebruik van recombinant DNA werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen van het institutioneel Bioveiligheidscomité (IBC) van Tulane University. 1. infectie van muizen met bloed-fase parasieten v…

Representative Results

Het succes van het toepassen van reverse genetische hulpmiddelen en technieken voor malariaparasieten heeft een revolutie teweeggebracht in het gebied van malaria onderzoek, met de mogelijkheid om toe te voegen, te verwijderen, of te wijzigen specifieke genomische segmenten van verschillende Plasmodium soorten39. Belangrijk is dat de uit te leggen genomische loci is geïdentificeerd en met succes gebruikt om fluorescentie eiwit markers in knaagdieren en me…

Discussion

Ondanks de gelijkenis in de algemene biologie van hun levenscycli tot die van menselijke malariaparasieten, hebben muizen malaria modellen ook veel gelijkenissen met menselijke Plasmodium soorten die hun gebruik als betrouwbaar in vivo modellen zouden beperken. Bijvoorbeeld, met uitzondering van levende verzwakte parasieten als vaccins, alle vaccin studies met subeenheid en DNA en andere vaccins gaven uitstekende resultaten in het muismodel, maar bij mensen die in endemische gebieden wonen, waren de res…

Materials

Heparin	Sigma	375095-100KU
Xanthurenic acid	Sigma	D120804-5G
Hypoxanthine	Sigma	H9377-25G
Alsever's solution	Sigma	A3551-500ML
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Phenylhydrazine	Sigma	P26252-5G
Glycerol	Sigma	G5516-500ML
Giemsa	Sigma	GS1L-1L
26G x 3/8 Precision Glide Needle,	Becton Dickinson	305110
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8	Becton Dickinson	309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G	Becton Dickinson	329412
Isoflurane, USB	Piramal	2667- 46- 7
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
RPMI	Gibco	22400105
DMEM	Gibco	11995065
Pencillin/ Streptomycin	Gibco	10378016
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147
Fiber Glass Wool	Corning	3950