이 보고서는 쥐 눈물샘 추출물, 오발 부민 및 완전 프로 인트 보조제의 유액으로 면역화하여 루이스 쥐의 만성 실험자가 면역안을 유도 한 다음, 눈물 결말과 눈물샘에 눈물샘 추출물과 오발 부민을 주사하는 방법에 대해 설명합니다 6 주 후에.
안구 건조증은 이환율과 건강 관리 부담을 초래하고 삶의 질을 저하시키는 매우 흔한 상태입니다. 자가 면역 건조한 눈 상태를 치료하기위한 신규 한 치료제를 시험하기위한 적합한 건조한 눈 동물 모델이 필요하다. 이 프로토콜은 만성자가 면역성 안구 건조 쥐 모델을 설명합니다. 루이스 래트는 눈물샘 추출물, 오발 부민 및 완전 프로 인트 보조제를 함유 한 유제로 면역화시켰다. 불완전 프로 인트 애쥬 번트에서 동일한 항원으로 2 차 면역화를 2 주 후에 실시 하였다. 이러한 면역화는 꼬리 기저부에서 피하 투여 하였다. 안구 표면과 눈물샘에서 면역 반응을 증가시키기 위해 눈물샘 밑 샘과 눈물샘에 눈물샘 추출물과 오발 부민을 1 차 면역 접종 6 주 후에 주입 하였다. 쥐들은 눈물 감소 생산 감소, 눈물의 안정성 감소, 각막 손상 증가와 같은 안구 건조 기능을 개발했습니다. 면역 전문가유세포 분석법에 의한 파일링은 안구 내에서 CD3 + 효과기 기억 T 세포의 우세를 보였다.
안구 건조증 (DED)은 안구 표면에 손상을 줄 수있는 불쾌감, 시각 장애 및 눈물 막 불안정성 증상을 유발하는 눈물과 안구 표면의 다원적 인 질병입니다. 그것은 눈물 막의 증가 된 삼투압과 안구 표면의 염증을 동반합니다. DED와 관련된 증상은 타는듯한 느낌, 쑤시는 느낌, 거친 느낌, 이물감, 눈물, 안구 피로 및 건조 함입니다 2 , 3 . DED의 두 가지 주요 원인은 눈물 분비 동맥에 의한 눈물 생성 감소와 눈물 막 4 의 과도한 증발입니다. Sjogren 증후군, 전신성 홍 반성 루푸스 및 류마티스 관절염과 같은자가 면역 질환 환자는 마이 보미 닉 (meibomian) 땀샘에 대한 면역 손상으로 눈물의 안정성에 필수적인 지질의 발현을 감소시킵니다. 또한, 안구 표면에 대한 면역 손상은 제품을 감소시킨다표면 습윤성에 중요한 점액의 존재. 함께이 과정들은 만성적으로 만성적 인 안구 건조증을 유발합니다 5 , 6 , 7 .
눈물 보충 및 항 염증 요법이 치료의 요점입니다. 그러나 DED ( 즉, 코르티코 스테로이드와 사이클로스포린)에 대한 현재의 항 염증 요법은 대체로 면역 억제제이며 심각한 부작용을 유발합니다 8 , 9 , 10 . 자가 면역 건조한 눈을 치료하기위한 새로운 면역 조절제를 시험하기에 적합한 동물 모델이 필요합니다.
특정 유전자 결함이있는 마우스 11 , 12 , 13 , 특정 유전자가 결핍 된 마우스 14 , 15 및 면역 반응을 과다 발현하는 형질 전환 마우스ory 유전자는자가 면역 건조한 안구 16,17의 모델로 사용되었습니다. 항원 – 유도자가 면역 동물 모델은 마우스 18 , 토끼 19 , 및 랫드 20 , 21 에서도보고되었다. 여기서는 만성자가 면역성 안구의 항원 유도 모델을 설명합니다. 이 모델은 두 개의 이전 모델을 수정 한 것입니다. 하나는 눈물샘 추출물을 사용했고 두 번째는 눈물샘 20 , 21 에서자가 항원 ( 즉, klk1b22)을 사용했습니다.
이 질병은 오발 부민, 완전 프로 인트 보조제 및 스프 라그 – 돌리 (Sprague-Dawley) 래트에서 눈물샘 추출물을 함유 한 유제 ( 그림 1 )를 가진 6 ~ 8 주령의 암컷 루이스 (Lewis) 쥐의 피하 면역화에 의해 유발되었습니다. 불완전 프로 인트 보조제에서 동일한 항원으로 두 번째 면역화2 주 후에 투여했다. 눈물샘과 안구 표면에 항원 특이 적 면역 세포를 모집하기 위해 눈샘 결막과 눈물샘에 눈물샘 추출물과 오발 부민 (1mg / mL)을 6 주 -7 주에 주사했다 ( 그림 1 ). 85 % 이상의 쥐가 첫 번째 예방 접종 후 70 일째에 마른 눈의 특징을 나타 냈습니다. 이러한 특징으로는 눈물 생성 감소 ( 그림 2 ), 각막의 형광 염색 증가 ( 그림 3 ), 눈물의 안정성 저하 ( 그림 4 )가 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 정상 쥐의 안구에서 T 세포의 면역 프로파일 링은 CD3 + 효과기 기억 T 세포의 우세를 나타낸다 ( 도 5 및 도 6 ). 자가 면역 DED를 가진 래트는 CD3 + 효과기 기억 T 세포의 증가와 순진 및 중추 성 기억 T 세포의 감소를 보여준다 ( 그림 6 </strong>).
이 프로토콜의 중요한 단계는 유제의 균질성을 확보하는 것입니다. 잘 준비된 유제에서 항원은 완전히 오일로 코팅되어 주입 된 항원의 느린 방출과 지속적인 면역 자극을 보장합니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 특징은 루이스 쥐의 사용이다. 루이스 쥐는 다른 계통보다자가 면역 질환 발병에 더 민감합니다 27 .
이 프로토콜은 눈물샘 추출물 만 사용하거나 재조합 Klk1b22 20 , 21 두 이전에 게시 된 프로토콜에서 수정되었습니다. 현재의 프로토콜에서, ovalbumin과 lacrimal gland 추출물이 항원으로 사용되며 항원 특이 적 면역 세포가 눈 표면과 눈물샘에 끌어 당겨 국소 조직 손상을 유도합니다. 건조한 눈은 초기 면역 후 48 일에 ~ 85 %까지 천천히 발달합니다. 항원에 대한 도전눈과 눈물샘은 48 일째 건조한 눈을 악화시키고 70 일까지 만성을 보장합니다.
Klk 유도 DED 모델의 재조합 Klk1b22와 비교할 때, 현 모델에서 사용 된 눈물샘 추출물과 오발 부민은 저렴하고 얻기 쉽다. 눈물샘 추출물에는자가 면역을 유도 할 수있는 Klk 이외의 다른 단백질도 포함되어 있으므로 이론적으로 DEL 유도시 Klk 방법보다 더 효과적입니다. 우리는 눈물샘 추출물만을 사용하여 쥐에게 면역 접종을 시도했다. 이들 면역화 된 래트가 DED를 생성 하였지만, 대조군에 비해 안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 유의 한 증가는 없었다.
이 기술의 한계는 모델을 완성하는 데 70 일이 걸린다는 것입니다. 이펙터 메모리 T 세포는 정상 쥐의 눈에서 주요 T 세포 서브 세트입니다. 이 모델에서자가 면역 DED는 안구 내 CD3 + effector memory T 세포를 증가시킵니다. 그 마약따라서 Kv1.3 칼륨 채널의 선택적 억제제와 같이 효과가있는 기억 세포 T 세포는자가 면역 DED 28 에 치료 효과가있을 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Tin Min Qi 박사와 Veluchamy Amutha Barathi 박사 팀에게 동물 치료에 대한 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 및 NMRC / CSA / 045 / 2012에서 지원되었습니다.
Reagents | |||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermal Scientific | 23227 | |
Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Becton, Dickinson and company | 231141 | |
complete Freund's adjuvant | Becton, Dickinson and company | 231131 | |
ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503-10G | |
incomplete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506-6X10ML | |
pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P7208-50UG | |
fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Sonicator | Sonics | Vibra-Cell | |
phenol red thread | Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. | NA | |
Stereo microscope with ring light illuminator and camera | Carl Zeiss | NA | |
Micro IV microscope | Phoenix Research Labs | NA |