该报告描述了通过用大鼠泪腺提取物,卵清蛋白和完全弗氏佐剂的乳液免疫在Lewis大鼠中诱导慢性实验性自身免疫性干眼的方法,随后将泪腺提取物和卵清蛋白注射入穹隆结膜下和泪腺六周后。
干眼病是一种非常常见的病症,导致发病率和医疗负担,降低生活质量。需要合适的干眼动物模型来测试新型治疗剂以治疗自身免疫性干眼症状。该方案描述了慢性自身免疫性干眼鼠模型。用含有泪腺提取物,卵清蛋白和完全弗氏佐剂的乳剂免疫Lewis大鼠。两周后给予不完全弗氏佐剂中具有相同抗原的第二次免疫。这些免疫接种在尾部的基部皮下施用。为了增强眼表面和泪腺的免疫反应,首次免疫6周后,将泪腺提取物和卵清蛋白注射入穹隆结膜下和泪腺。大鼠发展为干眼特征,包括泪液产生减少,撕裂稳定性降低,角膜损伤增加。免疫专业流式细胞分析显示,CD3 +效应记忆T细胞在眼球中占优势。
干眼症(DED)是眼泪和眼表的多因素疾病,导致不适,视觉障碍和泪膜不稳定症状,这可能导致眼表受损。它伴随着泪膜的渗透压增加和眼表1的炎症。与DED相关的症状是灼热,刺痛,烧伤,异物感,撕裂,眼睛疲劳和干燥2,3 。 DED的两个主要原因是减少泪液分泌腺体的泪液产生和撕裂膜4的过度蒸发。在患有自身免疫性疾病的患者中,例如干燥综合征,系统性红斑狼疮和类风湿关节炎对睑板腺的免疫损伤降低了对于泪液稳定性至关重要的脂质的表达。此外,对眼表的免疫损伤降低了产品对于表面润湿性很重要的粘蛋白。一起,这些过程累积地引起慢性干眼5,6,7 。
泪液替代和抗炎治疗是治疗的主要内容。然而,目前DED( 即皮质类固醇和环孢菌素)的抗炎疗法具有广泛的免疫抑制作用,导致严重的不良反应8,9,10 。需要合适的动物模型来测试新型免疫调节剂以治疗自身免疫性干眼症。
具有特定遗传缺陷的小鼠11,12,13 ,缺乏特异性基因的小鼠14,15和过表达免疫原性的转基因小鼠ory基因已被用作自身免疫干眼症的模型16,17 。抗原诱导的自身免疫动物模型也在小鼠18 ,兔子19和大鼠20,21 中报道。在这里,我们描述了抗原诱导的慢性自身免疫干眼模型。这个模型是两个早期模型的修改;一个使用泪腺提取物,第二个使用自体抗原( 即, klk1b22)来自泪腺20,21 。
通过用卵白蛋白,完全弗氏佐剂和含有Sprague-Dawley大鼠的泪腺提取物的乳剂( 图1 )皮下免疫6至8周龄的雌性Lewis大鼠诱导该疾病。在不完全弗氏佐剂中用相同抗原进行第二次免疫两周后给药。为了将抗原特异性免疫细胞募集到泪腺和眼表面,第6〜7周将泪腺提取物和卵白蛋白(1mg / mL)的混合物注射入穹隆结膜下和泪腺( 图1 )。超过85%的大鼠在第一次免疫后70天开始出现干眼症的特征。这些特征包括减少的泪液生成( 图2 ),增加的角膜荧光素染色( 图3 )和降低的撕裂稳定性( 图4 )。通过流式细胞术对正常大鼠眼球中的T细胞的免疫分析显示CD3 +效应记忆T细胞的优势( 图5和6 )。具有自身免疫性DED的大鼠显示CD3 +效应记忆T细胞的增加以及初始和中央记忆T细胞相应的减少( 图6 </stro纳克>)。
该方案的关键步骤是确保乳液的均匀性。在精心制备的乳剂中,抗原完全涂覆油,确保注射的抗原的缓慢释放和持续的免疫刺激。该方案的另一个关键特征是使用Lewis大鼠。 Lewis大鼠比其他菌株更敏感于自身免疫性疾病27 。
该协议已经从以前发布的两种方案中进行了修改,该协议既可以使用泪腺提取物,也可以使用重组Klk1b22 20,21 。在目前的方案中,使用卵白蛋白加泪腺提取物作为抗原,抗原特异性免疫细胞被吸引到眼表和泪腺,诱发局部组织损伤。干眼发展缓慢,初次免疫后第48天达到〜85%。抗原性挑战眼睛和泪腺在第48天加剧干眼症,并确保其长达七十岁的长期性。
与Klk诱导的DED模型中的重组Klk1b22相比,当前模型中使用的泪腺提取物和卵清蛋白更便宜,更容易获得。泪腺提取物还含有除了Klk之外的其他可能诱导自身免疫的蛋白质,因此在诱导DED时,该提取物在理论上比Klk方法更有效。我们也尝试只用泪腺提取物免疫大鼠;尽管这些免疫的大鼠发展为DED,但与对照组相比,眼球组织中效应记忆T细胞没有显着增加。
这种技术的局限性在于实现模型需要70天的时间。效应记忆T细胞是正常大鼠眼中的主要T细胞亚群。在该模型中,自身免疫性DED导致眼球中CD3 +效应记忆T细胞的增加。优先的药物临床上抑制效应记忆T细胞,例如Kv1.3钾通道的选择性抑制剂,因此可以对自身免疫性DED 28具有治疗益处。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Tin Min Qi女士和Veluchamy Amutha Barathi博士及其小组协助处理这些动物。这项工作得到NHIC-I2D-1409007,SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014和NMRC / CSA / 045/2012的支持。
Reagents | |||
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermal Scientific | 23227 | |
Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Becton, Dickinson and company | 231141 | |
complete Freund's adjuvant | Becton, Dickinson and company | 231131 | |
ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503-10G | |
incomplete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506-6X10ML | |
pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P7208-50UG | |
fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Sonicator | Sonics | Vibra-Cell | |
phenol red thread | Tianjin Jingming New Technological development Co. LTD. | NA | |
Stereo microscope with ring light illuminator and camera | Carl Zeiss | NA | |
Micro IV microscope | Phoenix Research Labs | NA |